做实验 http://bbs.91bio.com/group-show-id-1.html zh_cn © 2011 - 2012, ThinkSAAS. 2013-02-07 17:32:58 感受态细胞转化效率的检验 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-852.html
例如,取1μl(0.1 ng/μl)完整的质粒转化100μl的感受态细胞. 向转化反应液中加入900μl培养液,让细菌恢复一小段时间,取100μl铺板.培养过夜,产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA,用SOC稀释到1000μl后,取1/10涂平板,则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒,所以转化率=1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg。

转化效率1×10 6 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验;1×10 7 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆,有限量的DNA的转化,T-克隆实验;构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×10 8 cfu/μg DNA。]]>

例如,取1μl(0.1 ng/μl)完整的质粒转化100μl的感受态细胞. 向转化反应液中加入900μl培养液,让细菌恢复一小段时间,取100μl铺板.培养过夜,产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA,用SOC稀释到1000μl后,取1/10涂平板,则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒,所以转化率=1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg。

转化效率1×10 6 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验;1×10 7 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆,有限量的DNA的转化,T-克隆实验;构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×10 8 cfu/μg DNA。]]>
2012-09-06 11:04:51 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-852.html
转化的要点及疑难解析 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-851.html
1) 存放条件:超级感受态细胞对微小的温度改变也极度敏感,因此必须存放在–80°C冰箱的底部。即使是将细胞从一个冰箱转移到另一个冰箱也会导致转化效率的损失。采用BD Falcon 的14ml聚丙烯圆底试管:在转化实验中使用圆底14-ml BD Falcon聚丙烯试管(货号 #352059)也是关键之一。一般的试管容易被b-巯基乙醇降解。而极为重要的热激步骤的操作也是根据这种型号的试管优化的。

2) 分装细胞:分装细胞时务必保持置于冰上。将聚丙烯管放置在冰上等待细胞融化,分装的细胞装入预冷的试管中。而且,每次转化都用100 ml细胞也很重要,减少细胞体积必定减少转化效率。

2、 使用b-巯基乙醇(b-ME): 已经证明b-ME可以帮助提高转化效率。Stratagene提供的b-ME已经过稀释,可以直接使用。其它来源的b-ME使用时请参考相关文献。

3、 使用NZY+ 肉汤: Stratagene的超级、高级感受态细胞在热激处理后用NZY+ 培养基菌落生长最好。用其它培养基替代往往会造成效率降低。

4、 DNA的质量和用量:测定的最高转化效率的数值来自1 ml的0.01 ng/ml超螺旋pUC18 DNA转化100 ml 感受态细胞的实验结果。转化连接产物时,每100 ml细胞要求2 ml连接反应产物。通过使用50 ng DNA可以得到更多的克隆,但同时转化效率(cfu/mg) 有所降低。DNA溶液的体积可以增至总转化体系体积的10%,但是转化效率也相应降低。热激时间和温度: 最优的转化结果是采用42°C热激30秒。热激40秒均造成效率降低。温度不可超过42°C。

5、 蓝-白斑筛选: 特定重组质粒的蓝白斑筛选要求宿主菌含有F?附加体上的lacIqZ*M15 基因,而质粒提供a-互补(例如Stratagene的pBluescript? II系列载体等)。当IPTG诱导lacZ表达时,在含有发色底物X-gal的平板上,带有插入片段的重组质粒的克隆为白色,带有质粒却没有插入片段的克隆则为蓝色。做蓝白斑筛选时,将含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37°C下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4°C两小时,蓝色会加深。如果插入片段毒性较大,应采用没有X-gal and IPTG的培养平板。蓝白斑筛选虽然没办法做了,但是在没有IPTG时,毒蛋白或许有一定的表达。]]>

1) 存放条件:超级感受态细胞对微小的温度改变也极度敏感,因此必须存放在–80°C冰箱的底部。即使是将细胞从一个冰箱转移到另一个冰箱也会导致转化效率的损失。采用BD Falcon 的14ml聚丙烯圆底试管:在转化实验中使用圆底14-ml BD Falcon聚丙烯试管(货号 #352059)也是关键之一。一般的试管容易被b-巯基乙醇降解。而极为重要的热激步骤的操作也是根据这种型号的试管优化的。

2) 分装细胞:分装细胞时务必保持置于冰上。将聚丙烯管放置在冰上等待细胞融化,分装的细胞装入预冷的试管中。而且,每次转化都用100 ml细胞也很重要,减少细胞体积必定减少转化效率。

2、 使用b-巯基乙醇(b-ME): 已经证明b-ME可以帮助提高转化效率。Stratagene提供的b-ME已经过稀释,可以直接使用。其它来源的b-ME使用时请参考相关文献。

3、 使用NZY+ 肉汤: Stratagene的超级、高级感受态细胞在热激处理后用NZY+ 培养基菌落生长最好。用其它培养基替代往往会造成效率降低。

4、 DNA的质量和用量:测定的最高转化效率的数值来自1 ml的0.01 ng/ml超螺旋pUC18 DNA转化100 ml 感受态细胞的实验结果。转化连接产物时,每100 ml细胞要求2 ml连接反应产物。通过使用50 ng DNA可以得到更多的克隆,但同时转化效率(cfu/mg) 有所降低。DNA溶液的体积可以增至总转化体系体积的10%,但是转化效率也相应降低。热激时间和温度: 最优的转化结果是采用42°C热激30秒。热激40秒均造成效率降低。温度不可超过42°C。

5、 蓝-白斑筛选: 特定重组质粒的蓝白斑筛选要求宿主菌含有F?附加体上的lacIqZ*M15 基因,而质粒提供a-互补(例如Stratagene的pBluescript? II系列载体等)。当IPTG诱导lacZ表达时,在含有发色底物X-gal的平板上,带有插入片段的重组质粒的克隆为白色,带有质粒却没有插入片段的克隆则为蓝色。做蓝白斑筛选时,将含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37°C下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4°C两小时,蓝色会加深。如果插入片段毒性较大,应采用没有X-gal and IPTG的培养平板。蓝白斑筛选虽然没办法做了,但是在没有IPTG时,毒蛋白或许有一定的表达。]]>
2012-09-06 11:02:45 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-851.html
培养细胞应该养成的一些好习惯 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-850.html
2. Keep work area free of clutter

3. Correctly, legibly and informatively label all reagents including flasks and dishes with contents and date of preparation

4. Sanitize material such as pipet cans with 70% ethanol before taking them inside the hood

5. Put all material in hood before starting work (unless it clutters the work area)

6. Direct coughing, sneezing and speaking away from the hood

7. Do not put material on the edge of the hood over the vents

8. Dispose sharps such as pipetman tips, glass pipettes, needles and blades in the sharps container

9. Do not dispose non-biological material such as paper and liquids in the disposal bags

10. At end of work, sanitize the aspirator tubing with 70% ethanol while the vacuum is on

11. Examine cultures and media daily for gross microbial contamination

12. Do not continously use antibiotics in culture medium

13. Remember to turn off Pipet Aid

14. Turn on UV light at end of work

15. Rinse emptied glass bottles with tap water and leave some water inside

16. Work without antibiotics if possible

17. Get cells from reliable source

18. Keep records

19. Validate origin of cells

20. Check for mycoplasma when importing cells

21. When discarding liquid waste into beakers, place a sterile funnel over the beaker and discard into it.

22. When fitting a pipette intoa pipetting device, hold the pipette near the top, with its tip pointing away from you, inside the hood and away from any surface.]]>

2. Keep work area free of clutter

3. Correctly, legibly and informatively label all reagents including flasks and dishes with contents and date of preparation

4. Sanitize material such as pipet cans with 70% ethanol before taking them inside the hood

5. Put all material in hood before starting work (unless it clutters the work area)

6. Direct coughing, sneezing and speaking away from the hood

7. Do not put material on the edge of the hood over the vents

8. Dispose sharps such as pipetman tips, glass pipettes, needles and blades in the sharps container

9. Do not dispose non-biological material such as paper and liquids in the disposal bags

10. At end of work, sanitize the aspirator tubing with 70% ethanol while the vacuum is on

11. Examine cultures and media daily for gross microbial contamination

12. Do not continously use antibiotics in culture medium

13. Remember to turn off Pipet Aid

14. Turn on UV light at end of work

15. Rinse emptied glass bottles with tap water and leave some water inside

16. Work without antibiotics if possible

17. Get cells from reliable source

18. Keep records

19. Validate origin of cells

20. Check for mycoplasma when importing cells

21. When discarding liquid waste into beakers, place a sterile funnel over the beaker and discard into it.

22. When fitting a pipette intoa pipetting device, hold the pipette near the top, with its tip pointing away from you, inside the hood and away from any surface.]]>
2012-09-06 10:59:32 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-850.html
微生物试验常犯错误 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-846.html [*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]我在微生物试验犯的错误比较多,比如刚开始进实验室时候,无菌观念不强,结果污染过N次;后来污染解决了,本人比较懒,不做平行和梯度,结果浪费了时间,数据也不能用.现在好多了,我的体会是做试验别怕麻烦.[/font][/back][/size]
[*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]还有个很多人容易忽视问题就是——设计实验的时候不做对照,等实验做完了,虽然结果很好,就是用不了,特郁闷。[/font][/back][/size]
[*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]做实验不仅要注意细节,还要勤于思考,记得有一次我用酸液浸泡东西,不小心竟把一个铁皮盖放了进去,当时没做过多的思考,心想也让它消消毒吧。等两天以后去洗东西时,才发现只剩下铁皮上粘的一层薄纸了。现在想想,当时真是范晕,竟然把铁皮放进了强酸…………
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]一定要按照正规的步骤来,不能自行省略。
例如做菌种复苏的时候,有选择性培养基的最好用选择性培养基,这样培养出来的大概就可以确定是目的菌了。我以前用BHI(据说是很万能的培养基)复苏的菌种,结果到了后来才发现不是我需要的,而都是杂菌,耽误了很长的时间。
培养后,还要进行生化鉴定,革兰染色及PCR鉴定物种。
选择性培养基在经过了四十八小时的培养后,抗性降低,再培养出的可能就全是杂菌了。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]做微生物实验需要的是100%的细心,一点小小的粗心造成的结果就会很严重的,可能几天的功夫都白费了!
我提一个关于倒平板的小细节吧:怎样倒平板才能尽量少的产生冷凝水?
1.要等熔化的固体培养基温度大概被手背温度高一点(即不烫手背)的时候才开始倒。2.倒好的培养皿最好一个叠着一个,这样就让培养皿盖子的温度和培养基的温度不会相差太远,冷凝水就容易产生。[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]"怎样倒平板才能尽量少的产生冷凝水?"
1、如果是有抗性的平板可以,开开盖子,用洁净风在超净台里吹20min
2、正常的不烫手的温度倒平板大约40-50度之间即可
3、放在37度检菌1天的过程,也会使冷凝水蒸发,所以 呵呵 一举两得
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]微生物实验室可能大部分把用过的培养基(含菌的)直接作丢弃处理,没有经过彻底的灭菌,这样不仅污染了实验室本身人员的安全,还造成了极大的环境污染,危害是很大的,就SARS病毒研究过程中就出现过实验室由于不小心造成试验研究人员感染,这是十分危险且得不偿失的。
据我们老板讲(香港大学博士),在香港大学的研究室内,有专门的实验室垃圾处理人员,每天两次回收实验室产生的垃圾,经过彻底的高温高压灭菌之后才能做丢弃处理,这是对自己对大家的负责的做法,连装垃圾的带子都是统一订制的。我觉得这是很值得提倡的一项做法。
其实实验室条件如果达不到这种实力(可能大部分都很难达到),自己准备一个高压锅或者最简单的电炉子,长过菌的就拿去狠狠的煮煮,特别是芽孢杆菌之类难以消灭的,是对大家都有好处的。
[/font][/back][/size][*][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif][size=13px][back=#f7f7f7]菌株活化的时候,要先接到平板上,再挑取菌落摇菌,而不要贪图方便省了平板活化这一步。
[/back][/size][/font][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]高压灭过的固体材料,一般都有较多的冷凝水,问题不大但要烘干,一般是70度,时间至少三小时以上,保证没有冷凝水,这样一周内使用不会引起染菌.微生物实验的无菌要求是严格的,染菌的话,实验往往失败.
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]1 实验过程中要及时详细标清除产物和日期,实验做完以后要对以前的过度产品做个清理,以免东西积累过多,自己都搞不清楚是什么东西。
2 实验后的DNA和RNA要及时放回冰箱,以免时间长降解,特别是用水溶解的时候。
3 要及时甘油保存你鉴定出的细菌,每个细菌保存两份,存放在-80度冰箱里。
4 实验用的酶类虽然在室温下放一段时间也没什么问题,但还是要及时放回冰箱,以免活性降低。
5 要及时清理实验台面,该仍的东西及时扔掉,保持干净,整洁,有序。
6 无菌操作台用后及时清理干净,操作真菌,细菌,酵母,昆虫细胞最好不要交叉使用。
7 培养基使用的时候要注意无菌操作,移液器不要插入培养基中,之准许无菌枪头进入瓶子腔体,如培养基较少,可以倾斜瓶子,移液器取液体最好不要用到最大量程,以免吸液过猛导致与移液器接触。
8 灭好的培养基标签一定要写好,包括名称,日期,是否加抗生素,是否加抗生素非常重要,特别是在共用培养基的实验室。
9 实验用过的试剂盖子一定要盖好,以免挥发。特别是有毒的物品,如氯仿,苯酚等,用完后的瓶子及时拿出实验室。
10 带手套接触有毒物品后,要及时处理掉手套。不管是否接触过有毒物品,,不要戴着手套乱接触其他东西,如开窗等。
11 做实验过程中不要接电话,说话,考虑其他事情。特别是PCR和配溶液的时候。做PCR和配溶液的时候要把所用的试剂找全,一字排开,加完一种东西就把这种东西放到一边,可防止自己少加错东西。
12 同时作几个实验的时候一定要有定时器,防止自己忘记,特别是在煮东西,加热溶化溶液等危险操作的时候,切忌。
13 饭前,有活动前不要做实验,这时候匆匆忙忙非常容易出错,特别是作有危险的实验,更要注意。
14 作好试验记录,不管有没有结果,一定要坚持。还有点用图片,测序结果等,如果不清楚记录东西多了,就乱了,混了。这个一定要认真做好。
15 要随时写下自己的想法,因为有些想法稍纵即逝。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]挑选菌落时不应把接种针(环)在平板上看似空白的区域冷却,那样往往导致污染杂菌,因为好多匍匐生长的菌落肉眼根本不易发现
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]不知道是不是常犯,反正昨天犯了以后撞墙的心都有啦
晚上心急火燎的倒了两种平板,共约50块,因为时间紧,同时培养基又是一种白色一种黄色,就没有作标记就回去了
结果今天来了一看,全变成黄不拉唧一个色了,白的也不白了黄的也没那么黄了
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]酵母膏可以用硫酸纸称过之后直接放在溶液里 用玻璃棒搅拌溶解之后用镊子将硫酸纸取出
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]超净台需要定期清洗,不只是台面哦.而且需要色深的布遮住光是最好的(防止光修复)[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]微生物室比较常犯的错误如:
1.标识不明或者根本就不标识
2.不能有效地区分灭菌与非灭菌物品
3.交叉污染:在超净台上工作时,不能相应地区分清洁区、工作区、污染区;在清洁实验室时也容易发生交叉污染。
4.典型菌株在整个使用过程中不能有效防止泄漏。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]用过的长菌的平板和培养液,应该先在灭菌锅中高压灭菌后再扔掉,即便做的是对人畜无害的细菌,也要灭掉,据说会有噬菌体污染的情况出现。未被灭掉的细菌引来的噬菌体,造成整个实验室噬菌体污染,那样再做细菌培养就养不起来了~~~~而且没有办法除去噬菌体
培养基如果有水可以放在50度干燥箱烘30分钟,不过拿出来以后要冷却一段时间再使用~~~
听说过一个最笨的错误~~~一位猛人向超净台燃烧着酒精灯加酒精,结果自然是把超净台给烧了~~~而且这位猛人是研三的~~~~
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]看到大家的发言,受益匪浅,微生物试验虽然简单,但是很容易出错,细节不注意就会导致实验的失败,“细节出真知”,同样也适用于微生物试验,以下是有关接种环使用中的注意事项,希望和大家共同探讨交流
1、由被检验标本和培养物中取材观察细菌形态时,必须使用接种环。接种环或接种针每次使用前后,均须火焰灭菌。即在乙醇灯火焰上彻底烧灼1次,金属棒或玻璃棒部分亦须转动着通过火焰三次,用后灼烧时,先将近环处镍丝置于火焰中,使热导向接种环,如直接将环灼烧,则环上残余菌液可因突然受高热而爆裂四溅,有传染危险。待环上菌液蒸发干涸后,再将接种环以垂直方向于火焰中烧灼灭菌,最后再将金属棒或玻璃棒部分往复通过火焰。接种针用后灭菌时与接种环一样。
2、接种环(针)经火焰后,需待冷却后再沾取标本或置于工作台上,以防烫死微生物或烧损桌面。
3、由培养基或试管培养物中沾取标本时,培养瓶口、试管口在打开后及关闭前,应于火焰上通过1-2次,以杀死可能从空气中落入的杂菌和由培养物而来的致病菌。打开瓶塞或试管塞时,应将棉塞上端夹于手指间适当的位置,不得将棉塞任意放置别处。
4、不染色标本和染色标本观察后,应立即投入消毒液内灭菌。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]从我的实验来看在配置培养基时,如果对pH要求很精确的话,那最好采用过滤灭菌。因为
1)高温灭菌之后一般培养基的pH会降低
2)pH过低的培养基,尤其是ph<4,高温灭菌之后,琼脂发生变化,可能是降解了,固体培养基不会凝固!!!!!
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]微生物实验室最恐怖的就是污染问题了.要知道微生物是无处不在的.我觉得最常见,最头痛的就是菌种的污染了.
微生物实验室的工作人员时刻要记得我做事之前我用的东西确信是无菌的吗?
说说经常犯的一些错误吧.灭菌一定要记得标明时间.不然一多就忘了.
灭菌前保证物品干燥,EP管,枪头等记得在盒子里面放灭菌指示条.
无菌手套有时达不到效果,故用之前最好用75%酒精消消毒.
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]我是初学者,刚进实验室不久,无菌观念不强,常犯一些低级错误。
1.培养基灭菌一定要按照标准规定进行,有一次图省事,自己配完培养基后由于量比较少,所以就捎带着让别人给捎着灭了,结果没想到条件不一样,自己的培养基由于灭菌温度要求没人家高,结果分解了,导致配了半天白配。
2.铺完平板后,冷却后放培养箱时一定要倒着放,有一次没注意,结果两天后做实验时培养基上全是水,既耽误时间有影响心情。
我的经验就是做实验好习惯很重要,养成好习惯做起来就会很顺,否则就麻烦了。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]我进实验室后第一次用DNS法测酶活,因为中间有预热煮沸和冷却的等待时间,所以老师要求在空隙里穿插另外一个DNS酶活测试,第一次做的时候手忙脚乱,忙了这个忘那个。第二次做的时候我琢磨了一下,找了个小本,每做完一步就在本上记上,而且写明白这个步骤做完的时间和下个步骤开始的时间,两个实验各占纸的一面,这样哪步做了哪步没做就一目了然。呵呵,有点笨,但很管用。o(∩_∩)o...
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]说几点吧:微生物实验操作难度不是很大,主要就是细节问题多要注意,看到大家上面说的都很好,楼主的主题也是很好的,学到许多。在制备培养基时,牛肉膏等黏性大的物质,称量时最好直接加入要灭菌的三角瓶中(做法:现将三角瓶放到天平上清零后再加。加时为避免加入过量,可将牛肉膏一点点粘到瓶壁上,过了可以抿回,不要跟加入的其它药品混杂。)。进口蛋白胨等贵重物质最好准备一张专用秤量纸。为了避免交叉污染,药匙在秤量不同药品前一定要用卫生纸擦净。还有超净在紫外灭菌时要用黑布遮盖蔽光,防止菌的光复活。接种时接种环要沾酒精后在酒精灯上烧红,每次换皿前要用酒精灯烧红接种环,避免交叉污染。先想到这写,与大家共享。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]筛选新转化的菌落,一定要有耐心,一次图的大肠杆菌板子长了24小时才出现菌落,差点被我扔掉。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]使用接种环灭菌器时一定要注意。我做实验时经常用到,有时做多了就有点不耐烦。特别是灭菌粗接种环时,瞅着它老也烧不红就着急了,心想反正不用手扶也能放住,先做点别的,比如在试管上写上编号什么的,写完正好再次用到接种环,这时候再拿出来正好能用。一般都没事,但一组实验做到最后一个就容易出问题,因为这时不再用接种环了,往往等东西都清理完了才想起来,这时候再看接种环…………那叫一个惨不忍睹啊…………
我已经烧坏两个接种环了,现在,就是急死我也不敢把接种环直接放在接种环灭菌器里了!!!!!!!
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]细菌在冰箱4℃平板保藏时间不要过长,隔一两个月要转接一次,自己曾经保藏三个月的细菌在冰箱中早就变成冰碴喳了,悔啊~
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]我也是刚刚接触这方面的工作,这几天做质粒鉴定的实验刚刚犯下的错误,对新手可能有所借鉴,各位高手见笑了
1.在提质粒前,往往我们先对菌株进行保种,然后剩余的菌液用来提质粒。这个时候一定要做好标记,稍微一疏忽,就不知道那个质粒是对应那个菌株了,不然提出来质粒即使验证正确也不知道哪管是了。
2.跑电泳的时候,忘了检查电极了,结果全都倒着跑了,幸亏发现及时,还没有跑出去。师兄说,还好没跑出去,反过来接着跑还能回来,结果倒是可以。不过这种错误还是不要犯的好。
3.做实验的时候仔细点,刚刚开始做微生物及分子的实验,最好集中精力,一不留神就可能犯错误甚至很低级的错误,比如那天提质粒说着话一不小心把漂洗液pw当成平衡液BL用来平衡柱子了,哎,浪费了几个柱子都没敢吱声。
4.刚开始用移液器手发抖,特别是上样时,多练习练习,时间长了就好了,不要怀疑自己的选择,一个朋友说并非所有的外科医生都是天生拿手术刀的,我觉得有道理,时间长了就可以做好了。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]1.定期对菌株进行复壮
2.冰箱中保存的菌株进行转接,以防over.
3.灭菌锅要定期清洗,虽然用的是蒸馏水但也要经常清洗灭菌锅.特别是手提式灭菌锅,否则很容易将培养基污染(指带颜色的液体进入培养基)
3.刷培养皿时要小心,玻璃易碎!
4.使用pH计调节酸碱度时要注意电极,玻璃的易碎哦!
5工作台内尽量少的放东西,特别是有些东西长时间紫外照射容易分解掉。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]再说说接种环灭菌器。直接把接种环放进去有烧坏的风险,但是说“绝对不可以直接放”也不对,毕竟可以省一点时间。那么万一(请注意,是“万一”)接种环被烧坏了该怎么处理呢?
如果你发现接种环塑胶棒与金属棒相接的地方有些膨胀,或者塑胶棒轻微向下弯折,那么不要着急,它还有救。关掉灭菌器电源,一只手拿一个镊子,分别夹住接种环的金属棒和塑胶棒,小心从灭菌器中取出,平放在实验台上(不要接触纸或者纱布,会着火的。如果实验台不耐热,则需要垫上金属盘子),使塑胶棒和金属棒处在一条直线上,耐心等它冷却后,就可以再用了,只是膨胀的地方不会缩回去了,给你留个“纪念”。
如果你发现接种环已经被烧成“拔丝铁棒”,或者塑胶棒已经被烧成了“糖稀”,那你就要动作快点了,要不然“黑色糖稀”会粘得到处都是。这时候要关掉灭菌器电源,拿个废液缸盛大半缸水,用两个镊子分别夹着塑胶棒完整的部分和金属棒(不要夹“糖稀”或“拔丝”部分,夹不起来,并且会粘住镊子的),小心取出,放进水中使之冷却,把还可以再用的金属丝卸下来,然后再扔掉。如果废液缸是塑料的,注意不要使金属棒接触废液缸,否则他们“亲密接触”后就不好分开了。如果靠近水池,也可以用自来水冲淋冷却。千万不要把接种环直接仍在台面上,那样熔化的胶会粘在台面上,你就慢慢刮吧。
两种情况下都不可以用手直接去拿金属棒或者塑胶棒,除非你下定了决心,一定要给自己手上留点“记号”才能让自己心里长点“记性” 。
不要把接种环留在灭菌器内让它自己冷却,因为灭菌器关掉后仍有余热,把接种环留在里面只会使事情变得更糟糕。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]无菌操作前进行紫外线灭菌并不是时间越长越好,一般20-30分钟就可以了,因为一般都习惯一关紫外灯就可开始操作,如果时间太长在紫外线照射下氧气会变成臭氧,在风机吹后会被实验操作人员吹入,对身体是有害的。时间长菌会被杀死,可是人也有可能被害哦,建议关闭紫外灯后,用风机吹1-2分钟后再开始操作。[/font][/back][/size][/list]]]>
[*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]我在微生物试验犯的错误比较多,比如刚开始进实验室时候,无菌观念不强,结果污染过N次;后来污染解决了,本人比较懒,不做平行和梯度,结果浪费了时间,数据也不能用.现在好多了,我的体会是做试验别怕麻烦.[/font][/back][/size]
[*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]还有个很多人容易忽视问题就是——设计实验的时候不做对照,等实验做完了,虽然结果很好,就是用不了,特郁闷。[/font][/back][/size]
[*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]做实验不仅要注意细节,还要勤于思考,记得有一次我用酸液浸泡东西,不小心竟把一个铁皮盖放了进去,当时没做过多的思考,心想也让它消消毒吧。等两天以后去洗东西时,才发现只剩下铁皮上粘的一层薄纸了。现在想想,当时真是范晕,竟然把铁皮放进了强酸…………
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]一定要按照正规的步骤来,不能自行省略。
例如做菌种复苏的时候,有选择性培养基的最好用选择性培养基,这样培养出来的大概就可以确定是目的菌了。我以前用BHI(据说是很万能的培养基)复苏的菌种,结果到了后来才发现不是我需要的,而都是杂菌,耽误了很长的时间。
培养后,还要进行生化鉴定,革兰染色及PCR鉴定物种。
选择性培养基在经过了四十八小时的培养后,抗性降低,再培养出的可能就全是杂菌了。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]做微生物实验需要的是100%的细心,一点小小的粗心造成的结果就会很严重的,可能几天的功夫都白费了!
我提一个关于倒平板的小细节吧:怎样倒平板才能尽量少的产生冷凝水?
1.要等熔化的固体培养基温度大概被手背温度高一点(即不烫手背)的时候才开始倒。2.倒好的培养皿最好一个叠着一个,这样就让培养皿盖子的温度和培养基的温度不会相差太远,冷凝水就容易产生。[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]"怎样倒平板才能尽量少的产生冷凝水?"
1、如果是有抗性的平板可以,开开盖子,用洁净风在超净台里吹20min
2、正常的不烫手的温度倒平板大约40-50度之间即可
3、放在37度检菌1天的过程,也会使冷凝水蒸发,所以 呵呵 一举两得
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]微生物实验室可能大部分把用过的培养基(含菌的)直接作丢弃处理,没有经过彻底的灭菌,这样不仅污染了实验室本身人员的安全,还造成了极大的环境污染,危害是很大的,就SARS病毒研究过程中就出现过实验室由于不小心造成试验研究人员感染,这是十分危险且得不偿失的。
据我们老板讲(香港大学博士),在香港大学的研究室内,有专门的实验室垃圾处理人员,每天两次回收实验室产生的垃圾,经过彻底的高温高压灭菌之后才能做丢弃处理,这是对自己对大家的负责的做法,连装垃圾的带子都是统一订制的。我觉得这是很值得提倡的一项做法。
其实实验室条件如果达不到这种实力(可能大部分都很难达到),自己准备一个高压锅或者最简单的电炉子,长过菌的就拿去狠狠的煮煮,特别是芽孢杆菌之类难以消灭的,是对大家都有好处的。
[/font][/back][/size][*][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif][size=13px][back=#f7f7f7]菌株活化的时候,要先接到平板上,再挑取菌落摇菌,而不要贪图方便省了平板活化这一步。
[/back][/size][/font][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]高压灭过的固体材料,一般都有较多的冷凝水,问题不大但要烘干,一般是70度,时间至少三小时以上,保证没有冷凝水,这样一周内使用不会引起染菌.微生物实验的无菌要求是严格的,染菌的话,实验往往失败.
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]1 实验过程中要及时详细标清除产物和日期,实验做完以后要对以前的过度产品做个清理,以免东西积累过多,自己都搞不清楚是什么东西。
2 实验后的DNA和RNA要及时放回冰箱,以免时间长降解,特别是用水溶解的时候。
3 要及时甘油保存你鉴定出的细菌,每个细菌保存两份,存放在-80度冰箱里。
4 实验用的酶类虽然在室温下放一段时间也没什么问题,但还是要及时放回冰箱,以免活性降低。
5 要及时清理实验台面,该仍的东西及时扔掉,保持干净,整洁,有序。
6 无菌操作台用后及时清理干净,操作真菌,细菌,酵母,昆虫细胞最好不要交叉使用。
7 培养基使用的时候要注意无菌操作,移液器不要插入培养基中,之准许无菌枪头进入瓶子腔体,如培养基较少,可以倾斜瓶子,移液器取液体最好不要用到最大量程,以免吸液过猛导致与移液器接触。
8 灭好的培养基标签一定要写好,包括名称,日期,是否加抗生素,是否加抗生素非常重要,特别是在共用培养基的实验室。
9 实验用过的试剂盖子一定要盖好,以免挥发。特别是有毒的物品,如氯仿,苯酚等,用完后的瓶子及时拿出实验室。
10 带手套接触有毒物品后,要及时处理掉手套。不管是否接触过有毒物品,,不要戴着手套乱接触其他东西,如开窗等。
11 做实验过程中不要接电话,说话,考虑其他事情。特别是PCR和配溶液的时候。做PCR和配溶液的时候要把所用的试剂找全,一字排开,加完一种东西就把这种东西放到一边,可防止自己少加错东西。
12 同时作几个实验的时候一定要有定时器,防止自己忘记,特别是在煮东西,加热溶化溶液等危险操作的时候,切忌。
13 饭前,有活动前不要做实验,这时候匆匆忙忙非常容易出错,特别是作有危险的实验,更要注意。
14 作好试验记录,不管有没有结果,一定要坚持。还有点用图片,测序结果等,如果不清楚记录东西多了,就乱了,混了。这个一定要认真做好。
15 要随时写下自己的想法,因为有些想法稍纵即逝。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]挑选菌落时不应把接种针(环)在平板上看似空白的区域冷却,那样往往导致污染杂菌,因为好多匍匐生长的菌落肉眼根本不易发现
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]不知道是不是常犯,反正昨天犯了以后撞墙的心都有啦
晚上心急火燎的倒了两种平板,共约50块,因为时间紧,同时培养基又是一种白色一种黄色,就没有作标记就回去了
结果今天来了一看,全变成黄不拉唧一个色了,白的也不白了黄的也没那么黄了
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]酵母膏可以用硫酸纸称过之后直接放在溶液里 用玻璃棒搅拌溶解之后用镊子将硫酸纸取出
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]超净台需要定期清洗,不只是台面哦.而且需要色深的布遮住光是最好的(防止光修复)[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]微生物室比较常犯的错误如:
1.标识不明或者根本就不标识
2.不能有效地区分灭菌与非灭菌物品
3.交叉污染:在超净台上工作时,不能相应地区分清洁区、工作区、污染区;在清洁实验室时也容易发生交叉污染。
4.典型菌株在整个使用过程中不能有效防止泄漏。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]用过的长菌的平板和培养液,应该先在灭菌锅中高压灭菌后再扔掉,即便做的是对人畜无害的细菌,也要灭掉,据说会有噬菌体污染的情况出现。未被灭掉的细菌引来的噬菌体,造成整个实验室噬菌体污染,那样再做细菌培养就养不起来了~~~~而且没有办法除去噬菌体
培养基如果有水可以放在50度干燥箱烘30分钟,不过拿出来以后要冷却一段时间再使用~~~
听说过一个最笨的错误~~~一位猛人向超净台燃烧着酒精灯加酒精,结果自然是把超净台给烧了~~~而且这位猛人是研三的~~~~
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]看到大家的发言,受益匪浅,微生物试验虽然简单,但是很容易出错,细节不注意就会导致实验的失败,“细节出真知”,同样也适用于微生物试验,以下是有关接种环使用中的注意事项,希望和大家共同探讨交流
1、由被检验标本和培养物中取材观察细菌形态时,必须使用接种环。接种环或接种针每次使用前后,均须火焰灭菌。即在乙醇灯火焰上彻底烧灼1次,金属棒或玻璃棒部分亦须转动着通过火焰三次,用后灼烧时,先将近环处镍丝置于火焰中,使热导向接种环,如直接将环灼烧,则环上残余菌液可因突然受高热而爆裂四溅,有传染危险。待环上菌液蒸发干涸后,再将接种环以垂直方向于火焰中烧灼灭菌,最后再将金属棒或玻璃棒部分往复通过火焰。接种针用后灭菌时与接种环一样。
2、接种环(针)经火焰后,需待冷却后再沾取标本或置于工作台上,以防烫死微生物或烧损桌面。
3、由培养基或试管培养物中沾取标本时,培养瓶口、试管口在打开后及关闭前,应于火焰上通过1-2次,以杀死可能从空气中落入的杂菌和由培养物而来的致病菌。打开瓶塞或试管塞时,应将棉塞上端夹于手指间适当的位置,不得将棉塞任意放置别处。
4、不染色标本和染色标本观察后,应立即投入消毒液内灭菌。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]从我的实验来看在配置培养基时,如果对pH要求很精确的话,那最好采用过滤灭菌。因为
1)高温灭菌之后一般培养基的pH会降低
2)pH过低的培养基,尤其是ph<4,高温灭菌之后,琼脂发生变化,可能是降解了,固体培养基不会凝固!!!!!
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]微生物实验室最恐怖的就是污染问题了.要知道微生物是无处不在的.我觉得最常见,最头痛的就是菌种的污染了.
微生物实验室的工作人员时刻要记得我做事之前我用的东西确信是无菌的吗?
说说经常犯的一些错误吧.灭菌一定要记得标明时间.不然一多就忘了.
灭菌前保证物品干燥,EP管,枪头等记得在盒子里面放灭菌指示条.
无菌手套有时达不到效果,故用之前最好用75%酒精消消毒.
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]我是初学者,刚进实验室不久,无菌观念不强,常犯一些低级错误。
1.培养基灭菌一定要按照标准规定进行,有一次图省事,自己配完培养基后由于量比较少,所以就捎带着让别人给捎着灭了,结果没想到条件不一样,自己的培养基由于灭菌温度要求没人家高,结果分解了,导致配了半天白配。
2.铺完平板后,冷却后放培养箱时一定要倒着放,有一次没注意,结果两天后做实验时培养基上全是水,既耽误时间有影响心情。
我的经验就是做实验好习惯很重要,养成好习惯做起来就会很顺,否则就麻烦了。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]我进实验室后第一次用DNS法测酶活,因为中间有预热煮沸和冷却的等待时间,所以老师要求在空隙里穿插另外一个DNS酶活测试,第一次做的时候手忙脚乱,忙了这个忘那个。第二次做的时候我琢磨了一下,找了个小本,每做完一步就在本上记上,而且写明白这个步骤做完的时间和下个步骤开始的时间,两个实验各占纸的一面,这样哪步做了哪步没做就一目了然。呵呵,有点笨,但很管用。o(∩_∩)o...
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]说几点吧:微生物实验操作难度不是很大,主要就是细节问题多要注意,看到大家上面说的都很好,楼主的主题也是很好的,学到许多。在制备培养基时,牛肉膏等黏性大的物质,称量时最好直接加入要灭菌的三角瓶中(做法:现将三角瓶放到天平上清零后再加。加时为避免加入过量,可将牛肉膏一点点粘到瓶壁上,过了可以抿回,不要跟加入的其它药品混杂。)。进口蛋白胨等贵重物质最好准备一张专用秤量纸。为了避免交叉污染,药匙在秤量不同药品前一定要用卫生纸擦净。还有超净在紫外灭菌时要用黑布遮盖蔽光,防止菌的光复活。接种时接种环要沾酒精后在酒精灯上烧红,每次换皿前要用酒精灯烧红接种环,避免交叉污染。先想到这写,与大家共享。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]筛选新转化的菌落,一定要有耐心,一次图的大肠杆菌板子长了24小时才出现菌落,差点被我扔掉。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]使用接种环灭菌器时一定要注意。我做实验时经常用到,有时做多了就有点不耐烦。特别是灭菌粗接种环时,瞅着它老也烧不红就着急了,心想反正不用手扶也能放住,先做点别的,比如在试管上写上编号什么的,写完正好再次用到接种环,这时候再拿出来正好能用。一般都没事,但一组实验做到最后一个就容易出问题,因为这时不再用接种环了,往往等东西都清理完了才想起来,这时候再看接种环…………那叫一个惨不忍睹啊…………
我已经烧坏两个接种环了,现在,就是急死我也不敢把接种环直接放在接种环灭菌器里了!!!!!!!
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]细菌在冰箱4℃平板保藏时间不要过长,隔一两个月要转接一次,自己曾经保藏三个月的细菌在冰箱中早就变成冰碴喳了,悔啊~
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]我也是刚刚接触这方面的工作,这几天做质粒鉴定的实验刚刚犯下的错误,对新手可能有所借鉴,各位高手见笑了
1.在提质粒前,往往我们先对菌株进行保种,然后剩余的菌液用来提质粒。这个时候一定要做好标记,稍微一疏忽,就不知道那个质粒是对应那个菌株了,不然提出来质粒即使验证正确也不知道哪管是了。
2.跑电泳的时候,忘了检查电极了,结果全都倒着跑了,幸亏发现及时,还没有跑出去。师兄说,还好没跑出去,反过来接着跑还能回来,结果倒是可以。不过这种错误还是不要犯的好。
3.做实验的时候仔细点,刚刚开始做微生物及分子的实验,最好集中精力,一不留神就可能犯错误甚至很低级的错误,比如那天提质粒说着话一不小心把漂洗液pw当成平衡液BL用来平衡柱子了,哎,浪费了几个柱子都没敢吱声。
4.刚开始用移液器手发抖,特别是上样时,多练习练习,时间长了就好了,不要怀疑自己的选择,一个朋友说并非所有的外科医生都是天生拿手术刀的,我觉得有道理,时间长了就可以做好了。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f7f7f7][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]1.定期对菌株进行复壮
2.冰箱中保存的菌株进行转接,以防over.
3.灭菌锅要定期清洗,虽然用的是蒸馏水但也要经常清洗灭菌锅.特别是手提式灭菌锅,否则很容易将培养基污染(指带颜色的液体进入培养基)
3.刷培养皿时要小心,玻璃易碎!
4.使用pH计调节酸碱度时要注意电极,玻璃的易碎哦!
5工作台内尽量少的放东西,特别是有些东西长时间紫外照射容易分解掉。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]再说说接种环灭菌器。直接把接种环放进去有烧坏的风险,但是说“绝对不可以直接放”也不对,毕竟可以省一点时间。那么万一(请注意,是“万一”)接种环被烧坏了该怎么处理呢?
如果你发现接种环塑胶棒与金属棒相接的地方有些膨胀,或者塑胶棒轻微向下弯折,那么不要着急,它还有救。关掉灭菌器电源,一只手拿一个镊子,分别夹住接种环的金属棒和塑胶棒,小心从灭菌器中取出,平放在实验台上(不要接触纸或者纱布,会着火的。如果实验台不耐热,则需要垫上金属盘子),使塑胶棒和金属棒处在一条直线上,耐心等它冷却后,就可以再用了,只是膨胀的地方不会缩回去了,给你留个“纪念”。
如果你发现接种环已经被烧成“拔丝铁棒”,或者塑胶棒已经被烧成了“糖稀”,那你就要动作快点了,要不然“黑色糖稀”会粘得到处都是。这时候要关掉灭菌器电源,拿个废液缸盛大半缸水,用两个镊子分别夹着塑胶棒完整的部分和金属棒(不要夹“糖稀”或“拔丝”部分,夹不起来,并且会粘住镊子的),小心取出,放进水中使之冷却,把还可以再用的金属丝卸下来,然后再扔掉。如果废液缸是塑料的,注意不要使金属棒接触废液缸,否则他们“亲密接触”后就不好分开了。如果靠近水池,也可以用自来水冲淋冷却。千万不要把接种环直接仍在台面上,那样熔化的胶会粘在台面上,你就慢慢刮吧。
两种情况下都不可以用手直接去拿金属棒或者塑胶棒,除非你下定了决心,一定要给自己手上留点“记号”才能让自己心里长点“记性” 。
不要把接种环留在灭菌器内让它自己冷却,因为灭菌器关掉后仍有余热,把接种环留在里面只会使事情变得更糟糕。
[/font][/back][/size][*][size=13px][back=#f2f1fa][font='Helvetica Neue', Helvetica, Arial, sans-serif]无菌操作前进行紫外线灭菌并不是时间越长越好,一般20-30分钟就可以了,因为一般都习惯一关紫外灯就可开始操作,如果时间太长在紫外线照射下氧气会变成臭氧,在风机吹后会被实验操作人员吹入,对身体是有害的。时间长菌会被杀死,可是人也有可能被害哦,建议关闭紫外灯后,用风机吹1-2分钟后再开始操作。[/font][/back][/size][/list]]]>
2012-08-31 11:23:22 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-846.html
成骨细胞培养经验分享 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-841.html 选取新生SD大鼠的乳鼠(有参考书上新生24h的,鄙人试过72h的乳鼠,消化下来的成骨细胞活力也是很不错的),具体取材方法不详述。
2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中(PBS不要放太多,否则延长剪碎时间),用剪刀剪成1*1mm的组织快,越小越好(越小越能消化完全),一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml,37℃水浴中消化30min(目的是消化掉附着骨片上的结缔组织),离心去酶,加入2ml胶原酶2,水浴中继续消化1h(中间间隔晃动,使消化下来的胶原离开团块溶于液体中)。如此消化下来的混悬液可能比较稠,可以加适量的PBS,尽量让胶原溶于液体中,否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。离心后去掉上清液,用PBS悬浮细胞,如果发现还有很多的骨片,将骨片单独取出继续用胶原酶2做第二次消化,第一次胶原酶2消化的细胞悬液和第二次胶原酶2消化的细胞悬液混匀(如果担心胶原酶2会影响细胞的生长,可以将两次的悬液离心,去掉上清液后,用培养基重悬)
3.培养基问题:
当时选取培养基问题确实弄苦了自己,因为师兄他们的论文说使用的是高糖DMEM,所以也用这个,但是消化下来的细胞很难成活,后来改成同实验室做神经细胞培养使用的DMEM/F12培养基,消化下来的细胞完全可以成活下来。但是问题接踵而至,到了第五天时发现细胞铺满底壁的60%,此时只要一换液,第二天绝对培养基混浊,没有一瓶细胞活过7天的(比如今的公司倒闭的都快),怀疑是污染问题(因为正值夏季雨天),折腾到最后绝对保证所有的添加物都是过滤后才使用,死亡现象依然在上演。
后来联系到丁香园的一个战友,他那里用的是低糖的DMEM培养基,没有出现我的问题,建议我换用这个!我购买了一包GIBCO牌子的低糖DMEM培养基,使用后细胞生长良好,繁殖旺盛!没有出现死亡漂浮现象!
个人认为成骨细胞本来就是在血液循环不好的情况下生长的(相比神经细胞,肾细胞等),高糖无疑刺激了成骨细胞分泌胶原(类似既得生孩子还要挤过多的奶水不累死才怪),另过多的胶原很难在玻璃上贴牢靠,一换液就会漂浮,将细胞从底壁带下来。
4.培养瓶
起初偶使用的是25ml的玻璃培养瓶,这个东西简直太轻了,手指一触,它就乱动,后来改用50ml玻璃培养瓶,一只老鼠的头盖骨消化下来的细胞接种到50ml培养瓶中,7天后完全可以传代。见有参考书上讲5只老鼠的头盖骨接种到一个培养瓶中,简直是涂炭生灵,浪费大大的!
偶用的培养瓶在接种前,使用1%多聚赖氨酸快速包被(具体方法:每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸,尽量是底壁均铺满液体,拧上盖子,放置30min,倒掉1%多聚赖氨酸液体,用去离子水或PBS液冲洗两遍),加进细胞悬液后,适度摇晃几次,是悬液均匀铺在瓶底!这样可以避免底壁出现细胞不均匀的现象,包括传代时也要如此。
包被的培养瓶,细胞很容易贴壁,我观察的是15min后就完全贴壁。
5. 关于培养基的PH值问题
市面的上的PH试纸真的不是很准确,测多了都不相信自己的眼睛了。鄙人利用血气分析仪器,确定了到100ml培养基加多少ml的1M的NaOH,后来发现不调PH值的培养基中细胞也活的很好,完全不是查阅到的论文一定要把PH值细胞才能活下来。建议不调最好,调过了细胞死翘翘了,真不知道问题出在哪里!尽量不要调PH值,勾兑上血清直接使用完全可以。
还有一个问题是GIBCO的粉状培养基配制是要加碳酸氢钠的(GIBCO牌子培养基特别搞笑,一大盒培养基里面有10小包,大盒子的外面包装上注明了加多少的碳酸氢钠,但里面的小包上面完全没有,如果你只购买了一小包,千万别忘了问试剂公司大盒子上面注明的碳酸氢钠加入的量),如果你老板有钱,那你就买液体的,省的费时配制!
5.有关污染的问题
加了双抗的培养基很少会引起细菌感染的,真菌感染就难预防了,特别是在夏季比较潮湿,真菌孢子空气里游荡的很多,一不小心飘进一个就污染,几天后就在培养瓶中变成一大团。
将50ml的培养瓶加上3ml培养基,盖子拧松放置在CO2孵箱里21天,盖子下缘长满了绿毛毛,但是培养基依然澄清!所以推论,孵箱里虾兵蟹将的真不少。处理完培养瓶,用酒精纱布搽试瓶盖和瓶颈。如此做下来没有出现过污染的问题!
鄙人使用的是国产的牛血清,感觉还不错,没有想象中支原体问题严重。]]>
选取新生SD大鼠的乳鼠(有参考书上新生24h的,鄙人试过72h的乳鼠,消化下来的成骨细胞活力也是很不错的),具体取材方法不详述。
2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中(PBS不要放太多,否则延长剪碎时间),用剪刀剪成1*1mm的组织快,越小越好(越小越能消化完全),一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml,37℃水浴中消化30min(目的是消化掉附着骨片上的结缔组织),离心去酶,加入2ml胶原酶2,水浴中继续消化1h(中间间隔晃动,使消化下来的胶原离开团块溶于液体中)。如此消化下来的混悬液可能比较稠,可以加适量的PBS,尽量让胶原溶于液体中,否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。离心后去掉上清液,用PBS悬浮细胞,如果发现还有很多的骨片,将骨片单独取出继续用胶原酶2做第二次消化,第一次胶原酶2消化的细胞悬液和第二次胶原酶2消化的细胞悬液混匀(如果担心胶原酶2会影响细胞的生长,可以将两次的悬液离心,去掉上清液后,用培养基重悬)
3.培养基问题:
当时选取培养基问题确实弄苦了自己,因为师兄他们的论文说使用的是高糖DMEM,所以也用这个,但是消化下来的细胞很难成活,后来改成同实验室做神经细胞培养使用的DMEM/F12培养基,消化下来的细胞完全可以成活下来。但是问题接踵而至,到了第五天时发现细胞铺满底壁的60%,此时只要一换液,第二天绝对培养基混浊,没有一瓶细胞活过7天的(比如今的公司倒闭的都快),怀疑是污染问题(因为正值夏季雨天),折腾到最后绝对保证所有的添加物都是过滤后才使用,死亡现象依然在上演。
后来联系到丁香园的一个战友,他那里用的是低糖的DMEM培养基,没有出现我的问题,建议我换用这个!我购买了一包GIBCO牌子的低糖DMEM培养基,使用后细胞生长良好,繁殖旺盛!没有出现死亡漂浮现象!
个人认为成骨细胞本来就是在血液循环不好的情况下生长的(相比神经细胞,肾细胞等),高糖无疑刺激了成骨细胞分泌胶原(类似既得生孩子还要挤过多的奶水不累死才怪),另过多的胶原很难在玻璃上贴牢靠,一换液就会漂浮,将细胞从底壁带下来。
4.培养瓶
起初偶使用的是25ml的玻璃培养瓶,这个东西简直太轻了,手指一触,它就乱动,后来改用50ml玻璃培养瓶,一只老鼠的头盖骨消化下来的细胞接种到50ml培养瓶中,7天后完全可以传代。见有参考书上讲5只老鼠的头盖骨接种到一个培养瓶中,简直是涂炭生灵,浪费大大的!
偶用的培养瓶在接种前,使用1%多聚赖氨酸快速包被(具体方法:每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸,尽量是底壁均铺满液体,拧上盖子,放置30min,倒掉1%多聚赖氨酸液体,用去离子水或PBS液冲洗两遍),加进细胞悬液后,适度摇晃几次,是悬液均匀铺在瓶底!这样可以避免底壁出现细胞不均匀的现象,包括传代时也要如此。
包被的培养瓶,细胞很容易贴壁,我观察的是15min后就完全贴壁。
5. 关于培养基的PH值问题
市面的上的PH试纸真的不是很准确,测多了都不相信自己的眼睛了。鄙人利用血气分析仪器,确定了到100ml培养基加多少ml的1M的NaOH,后来发现不调PH值的培养基中细胞也活的很好,完全不是查阅到的论文一定要把PH值细胞才能活下来。建议不调最好,调过了细胞死翘翘了,真不知道问题出在哪里!尽量不要调PH值,勾兑上血清直接使用完全可以。
还有一个问题是GIBCO的粉状培养基配制是要加碳酸氢钠的(GIBCO牌子培养基特别搞笑,一大盒培养基里面有10小包,大盒子的外面包装上注明了加多少的碳酸氢钠,但里面的小包上面完全没有,如果你只购买了一小包,千万别忘了问试剂公司大盒子上面注明的碳酸氢钠加入的量),如果你老板有钱,那你就买液体的,省的费时配制!
5.有关污染的问题
加了双抗的培养基很少会引起细菌感染的,真菌感染就难预防了,特别是在夏季比较潮湿,真菌孢子空气里游荡的很多,一不小心飘进一个就污染,几天后就在培养瓶中变成一大团。
将50ml的培养瓶加上3ml培养基,盖子拧松放置在CO2孵箱里21天,盖子下缘长满了绿毛毛,但是培养基依然澄清!所以推论,孵箱里虾兵蟹将的真不少。处理完培养瓶,用酒精纱布搽试瓶盖和瓶颈。如此做下来没有出现过污染的问题!
鄙人使用的是国产的牛血清,感觉还不错,没有想象中支原体问题严重。]]>
2012-08-28 14:14:19 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-841.html
血凝抑制试验操作注意事项:(微量法) http://bbs.91bio.com/group-topic-id-840.html
同样的道理加入红细胞的判定时间也是决定抗体高低的关键因素,我这里有照片在早判定和晚判定大多数会高低相差1log2,也就是2倍,经常实践操作的人一定知道这个误差的,因此何时为最佳判定时间呢?我个人认为不能简单的按照书上说的30min后判定,应该按照你的阴性和阳性对照的最佳沉淀和凝集时间,因为你的阴性对照会沉淀,阳性对照会凝集,这个时间是可以随你的加样的准确性和环境的温湿度而变化的,也就是你的最佳坐标,所以红细胞加入后判定结果的时间就是你的阴阳性对照成立的那一刻,即为你结果出现的时刻。

2、关于50%和100%凝集的判定:这也是操作者头疼的问题,有时候似凝非凝似陈非沉的很难判定,这个决定我告诉你就更简单了,严格判定,完全按照100%沉淀(血凝抑制)或者凝集(血凝实验)即可。把所有似是而非的东西东摒弃,就是一刀切,严格在严格的判定,宁低不宁高。

3、4单位抗原的标定:这是血凝试验很重要的关键因素,做实验的人善于思考的人一定会很重视4单位抗原的重要性。

但是我问大家为什么是4单位抗原而不是5单位6单位呢?为什么传支有时候又是8单位抗原呢?到底4单位抗原这个标尺怎么标定?怎么判定?怎么稀释?加样时需要注意些什么呢?

4、鸡场(养殖场)和实验室(研究所、大专院校)操作存在异同点等等。其他的细小细节等等等········]]>

同样的道理加入红细胞的判定时间也是决定抗体高低的关键因素,我这里有照片在早判定和晚判定大多数会高低相差1log2,也就是2倍,经常实践操作的人一定知道这个误差的,因此何时为最佳判定时间呢?我个人认为不能简单的按照书上说的30min后判定,应该按照你的阴性和阳性对照的最佳沉淀和凝集时间,因为你的阴性对照会沉淀,阳性对照会凝集,这个时间是可以随你的加样的准确性和环境的温湿度而变化的,也就是你的最佳坐标,所以红细胞加入后判定结果的时间就是你的阴阳性对照成立的那一刻,即为你结果出现的时刻。

2、关于50%和100%凝集的判定:这也是操作者头疼的问题,有时候似凝非凝似陈非沉的很难判定,这个决定我告诉你就更简单了,严格判定,完全按照100%沉淀(血凝抑制)或者凝集(血凝实验)即可。把所有似是而非的东西东摒弃,就是一刀切,严格在严格的判定,宁低不宁高。

3、4单位抗原的标定:这是血凝试验很重要的关键因素,做实验的人善于思考的人一定会很重视4单位抗原的重要性。

但是我问大家为什么是4单位抗原而不是5单位6单位呢?为什么传支有时候又是8单位抗原呢?到底4单位抗原这个标尺怎么标定?怎么判定?怎么稀释?加样时需要注意些什么呢?

4、鸡场(养殖场)和实验室(研究所、大专院校)操作存在异同点等等。其他的细小细节等等等········]]>
2012-08-28 13:34:01 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-840.html
各种细胞裂解液的功用 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-839.html
SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。
NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。

但是去垢剂属性只是一方面,buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素,建议参考《分子克隆》来做。]]>

SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。
NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。

但是去垢剂属性只是一方面,buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素,建议参考《分子克隆》来做。]]>
2012-08-26 16:56:29 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-839.html
细胞培养常见问题分析 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-838.html
取出冷冻管后, 须立即放入37 ℃水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。

2、细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?

除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3、可否使用与原先培养条件不同之培养基?

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。

4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类?

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源, 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统, 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。

7、何时须更换培养基?

视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。

8、培养基中是否须添加抗生素?

除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。

9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 ℃,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。

10、悬浮性细胞应如何继代处理?

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。
11、欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。

12、细胞之接种密度为何?

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

13、细胞冷冻培养基之成份为何?

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。

14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?

冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌状况, 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

15、冷冻保存细胞之方法?

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

15、细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

16、应如何避免细胞污染?

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

17、如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。

18、支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?

不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。

19、支原体污染会对细胞培养有何影响?

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。

20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

21、为何培养基保存于4 ℃ 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 且pH值会越来越偏碱性?
培养基保存于4 ℃ 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。

22、各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?

不同厂牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 虽对大部分细胞没有太大之影响, 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

23、购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形? 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后, 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。

24、收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?

冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧 。

25、如何选用特殊细胞系培养基?

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养最好首选AIM V(12005)培养基(SFM)。

26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

27、GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

28、什么培养基中可以省去加酚红?

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。
30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

31、书上说,Hank‘s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle‘s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。]]>

取出冷冻管后, 须立即放入37 ℃水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。

2、细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?

除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3、可否使用与原先培养条件不同之培养基?

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。

4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类?

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源, 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统, 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。

7、何时须更换培养基?

视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。

8、培养基中是否须添加抗生素?

除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。

9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 ℃,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。

10、悬浮性细胞应如何继代处理?

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。
11、欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。

12、细胞之接种密度为何?

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

13、细胞冷冻培养基之成份为何?

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。

14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?

冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌状况, 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

15、冷冻保存细胞之方法?

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

15、细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

16、应如何避免细胞污染?

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

17、如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。

18、支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?

不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。

19、支原体污染会对细胞培养有何影响?

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。

20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

21、为何培养基保存于4 ℃ 冰箱中, 颜色会偏暗红色, 且pH值会越来越偏碱性?
培养基保存于4 ℃ 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。

22、各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?

不同厂牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 虽对大部分细胞没有太大之影响, 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

23、购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形? 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后, 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80℃太久。

24、收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?

冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧 。

25、如何选用特殊细胞系培养基?

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养最好首选AIM V(12005)培养基(SFM)。

26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

27、GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

28、什么培养基中可以省去加酚红?

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。
30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

31、书上说,Hank‘s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle‘s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。]]>
2012-08-26 16:52:23 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-838.html
细胞培养中无菌操作技术 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-837.html
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管、吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面的中央无菌区域,勿在边缘的非无菌区域操作。

3. 小心取用无菌的实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口,亦不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身的安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染的细胞株应特别小心操作,并选择适当等级的无菌操作台(至少Class II)。操作过程中,应避免引起aerosol 的产生,小心毒性药品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖锐针头的伤害等。

5. 定期检测下列项目:

5.1. CO2 钢瓶的CO2 压力

5.2. CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。

5.3. 无菌操作台内的airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。]]>

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管、吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面的中央无菌区域,勿在边缘的非无菌区域操作。

3. 小心取用无菌的实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口,亦不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身的安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染的细胞株应特别小心操作,并选择适当等级的无菌操作台(至少Class II)。操作过程中,应避免引起aerosol 的产生,小心毒性药品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖锐针头的伤害等。

5. 定期检测下列项目:

5.1. CO2 钢瓶的CO2 压力

5.2. CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。

5.3. 无菌操作台内的airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。]]>
2012-08-26 16:51:18 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-837.html
荧光blotting的小贴士 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-13.html • 从化学发光转到荧光检测时,一抗浓度应当增加;通常来说是增加2-5倍。二抗浓度可能也需要优化;1:5,000稀释是个不错的起点。在使用特定抗体时,可以参照生产商的建议。
• 为了让信噪比最高,应使用自发荧光低的膜,如 Immun-Blot® low fluorescence (LF) PVDF membrane。
• 许多封闭液都成功用于荧光检测。我们建议使用0.5-5% 酪蛋白、最多5%的脱脂奶粉,或最多3% BSA,溶于TTBS中。
• 缓冲液中的颗粒可能停留在膜上,并造成荧光假象。只使用高质量的试剂,并对所有缓冲液过滤灭菌。
• 使用钝的镊子从边缘操作。避免划破膜或弄皱,这会在荧光检测时造成假象。
• 使用铅笔来标记膜,因为许多墨水都会发出荧光。
• 溴酚蓝会发出荧光。确保染料与样品已分开,切掉凝胶上包含染料的部分,或省掉样品缓冲液中的溴酚蓝。
• 无需在暗处开展免疫检测;正常的室内灯光不会使荧光标记的抗体发生光漂白。不过,荧光标记抗体的储液应保存在暗处。
• 在处理膜时,使用无粉末的手套,以避免膜上出现假象或指纹。[/font]

[font=Arial][b]多重分析的小贴士[/b][/font]

[font=Arial]• 使用来自不同宿主的一抗(如小鼠和兔)。两个亲缘关系相近物种的抗体(如大鼠和小鼠)通常会造成交叉反应,即使抗体已经过交叉吸附。
• 使用经过交叉吸附的二抗,以避免交叉反应。
• 使用光谱上不同的荧光基团偶联物,避免交叉通道荧光。
• 在同时检测多个目标之前,单独优化每个目标的检测。由于一些一抗并非很特异,在膜上会产生多条带,故多重实验之前的单目标检测将有助于确定每个抗体的条带模式。
• 大部分膜在波长较短的激发光下会显示出较高的背景。记住,在蓝色通道检测最强的目标,在绿色通道检测中等目标,而保留红色通道来检测最弱的目标。[/font]]]>
• 从化学发光转到荧光检测时,一抗浓度应当增加;通常来说是增加2-5倍。二抗浓度可能也需要优化;1:5,000稀释是个不错的起点。在使用特定抗体时,可以参照生产商的建议。
• 为了让信噪比最高,应使用自发荧光低的膜,如 Immun-Blot® low fluorescence (LF) PVDF membrane。
• 许多封闭液都成功用于荧光检测。我们建议使用0.5-5% 酪蛋白、最多5%的脱脂奶粉,或最多3% BSA,溶于TTBS中。
• 缓冲液中的颗粒可能停留在膜上,并造成荧光假象。只使用高质量的试剂,并对所有缓冲液过滤灭菌。
• 使用钝的镊子从边缘操作。避免划破膜或弄皱,这会在荧光检测时造成假象。
• 使用铅笔来标记膜,因为许多墨水都会发出荧光。
• 溴酚蓝会发出荧光。确保染料与样品已分开,切掉凝胶上包含染料的部分,或省掉样品缓冲液中的溴酚蓝。
• 无需在暗处开展免疫检测;正常的室内灯光不会使荧光标记的抗体发生光漂白。不过,荧光标记抗体的储液应保存在暗处。
• 在处理膜时,使用无粉末的手套,以避免膜上出现假象或指纹。[/font]

[font=Arial][b]多重分析的小贴士[/b][/font]

[font=Arial]• 使用来自不同宿主的一抗(如小鼠和兔)。两个亲缘关系相近物种的抗体(如大鼠和小鼠)通常会造成交叉反应,即使抗体已经过交叉吸附。
• 使用经过交叉吸附的二抗,以避免交叉反应。
• 使用光谱上不同的荧光基团偶联物,避免交叉通道荧光。
• 在同时检测多个目标之前,单独优化每个目标的检测。由于一些一抗并非很特异,在膜上会产生多条带,故多重实验之前的单目标检测将有助于确定每个抗体的条带模式。
• 大部分膜在波长较短的激发光下会显示出较高的背景。记住,在蓝色通道检测最强的目标,在绿色通道检测中等目标,而保留红色通道来检测最弱的目标。[/font]]]>
2012-08-06 16:45:56 http://bbs.91bio.com/group-topic-id-13.html