[技巧经验]成骨细胞培养经验分享

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sharebio 2012-08-28 14:14:19

1.成骨细胞的取材:
选取新生SD大鼠的乳鼠(有参考书上新生24h的,鄙人试过72h的乳鼠,消化下来的成骨细胞活力也是很不错的),具体取材方法不详述。
2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中(PBS不要放太多,否则延长剪碎时间),用剪刀剪成1*1mm的组织快,越小越好(越小越能消化完全),一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml,37℃水浴中消化30min(目的是消化掉附着骨片上的结缔组织),离心去酶,加入2ml胶原酶2,水浴中继续消化1h(中间间隔晃动,使消化下来的胶原离开团块溶于液体中)。如此消化下来的混悬液可能比较稠,可以加适量的PBS,尽量让胶原溶于液体中,否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。离心后去掉上清液,用PBS悬浮细胞,如果发现还有很多的骨片,将骨片单独取出继续用胶原酶2做第二次消化,第一次胶原酶2消化的细胞悬液和第二次胶原酶2消化的细胞悬液混匀(如果担心胶原酶2会影响细胞的生长,可以将两次的悬液离心,去掉上清液后,用培养基重悬)
3.培养基问题:
当时选取培养基问题确实弄苦了自己,因为师兄他们的论文说使用的是高糖DMEM,所以也用这个,但是消化下来的细胞很难成活,后来改成同实验室做神经细胞培养使用的DMEM/F12培养基,消化下来的细胞完全可以成活下来。但是问题接踵而至,到了第五天时发现细胞铺满底壁的60%,此时只要一换液,第二天绝对培养基混浊,没有一瓶细胞活过7天的(比如今的公司倒闭的都快),怀疑是污染问题(因为正值夏季雨天),折腾到最后绝对保证所有的添加物都是过滤后才使用,死亡现象依然在上演。
后来联系到丁香园的一个战友,他那里用的是低糖的DMEM培养基,没有出现我的问题,建议我换用这个!我购买了一包GIBCO牌子的低糖DMEM培养基,使用后细胞生长良好,繁殖旺盛!没有出现死亡漂浮现象!
个人认为成骨细胞本来就是在血液循环不好的情况下生长的(相比神经细胞,肾细胞等),高糖无疑刺激了成骨细胞分泌胶原(类似既得生孩子还要挤过多的奶水不累死才怪),另过多的胶原很难在玻璃上贴牢靠,一换液就会漂浮,将细胞从底壁带下来。
4.培养瓶
起初偶使用的是25ml的玻璃培养瓶,这个东西简直太轻了,手指一触,它就乱动,后来改用50ml玻璃培养瓶,一只老鼠的头盖骨消化下来的细胞接种到50ml培养瓶中,7天后完全可以传代。见有参考书上讲5只老鼠的头盖骨接种到一个培养瓶中,简直是涂炭生灵,浪费大大的!
偶用的培养瓶在接种前,使用1%多聚赖氨酸快速包被(具体方法:每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸,尽量是底壁均铺满液体,拧上盖子,放置30min,倒掉1%多聚赖氨酸液体,用去离子水或PBS液冲洗两遍),加进细胞悬液后,适度摇晃几次,是悬液均匀铺在瓶底!这样可以避免底壁出现细胞不均匀的现象,包括传代时也要如此。
包被的培养瓶,细胞很容易贴壁,我观察的是15min后就完全贴壁。
5. 关于培养基的PH值问题
市面的上的PH试纸真的不是很准确,测多了都不相信自己的眼睛了。鄙人利用血气分析仪器,确定了到100ml培养基加多少ml的1M的NaOH,后来发现不调PH值的培养基中细胞也活的很好,完全不是查阅到的论文一定要把PH值细胞才能活下来。建议不调最好,调过了细胞死翘翘了,真不知道问题出在哪里!尽量不要调PH值,勾兑上血清直接使用完全可以。
还有一个问题是GIBCO的粉状培养基配制是要加碳酸氢钠的(GIBCO牌子培养基特别搞笑,一大盒培养基里面有10小包,大盒子的外面包装上注明了加多少的碳酸氢钠,但里面的小包上面完全没有,如果你只购买了一小包,千万别忘了问试剂公司大盒子上面注明的碳酸氢钠加入的量),如果你老板有钱,那你就买液体的,省的费时配制!
5.有关污染的问题
加了双抗的培养基很少会引起细菌感染的,真菌感染就难预防了,特别是在夏季比较潮湿,真菌孢子空气里游荡的很多,一不小心飘进一个就污染,几天后就在培养瓶中变成一大团。
将50ml的培养瓶加上3ml培养基,盖子拧松放置在CO2孵箱里21天,盖子下缘长满了绿毛毛,但是培养基依然澄清!所以推论,孵箱里虾兵蟹将的真不少。处理完培养瓶,用酒精纱布搽试瓶盖和瓶颈。如此做下来没有出现过污染的问题!
鄙人使用的是国产的牛血清,感觉还不错,没有想象中支原体问题严重。
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