[糗事教训]微生物试验常犯错误

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sharebio 2012-08-31 11:23:22

  • 实验室很多人习惯把要刷的平板、研钵、吸管等先放在水池里,等一段时间再刷 但是水池里面会有人倒少量的有机溶剂(稀释后),洗电泳槽的水也倒在水池里。这样的话会污染平板、研钵....,如果洗不干净的话会影响微生物的培养。建议大家不要把要洗的东西放在水池里
  • 我在微生物试验犯的错误比较多,比如刚开始进实验室时候,无菌观念不强,结果污染过N次;后来污染解决了,本人比较懒,不做平行和梯度,结果浪费了时间,数据也不能用.现在好多了,我的体会是做试验别怕麻烦.
  • 还有个很多人容易忽视问题就是——设计实验的时候不做对照,等实验做完了,虽然结果很好,就是用不了,特郁闷。
  • 做实验不仅要注意细节,还要勤于思考,记得有一次我用酸液浸泡东西,不小心竟把一个铁皮盖放了进去,当时没做过多的思考,心想也让它消消毒吧。等两天以后去洗东西时,才发现只剩下铁皮上粘的一层薄纸了。现在想想,当时真是范晕,竟然把铁皮放进了强酸…………
  • 一定要按照正规的步骤来,不能自行省略。
    例如做菌种复苏的时候,有选择性培养基的最好用选择性培养基,这样培养出来的大概就可以确定是目的菌了。我以前用BHI(据说是很万能的培养基)复苏的菌种,结果到了后来才发现不是我需要的,而都是杂菌,耽误了很长的时间。
    培养后,还要进行生化鉴定,革兰染色及PCR鉴定物种。
    选择性培养基在经过了四十八小时的培养后,抗性降低,再培养出的可能就全是杂菌了。
  • 做微生物实验需要的是100%的细心,一点小小的粗心造成的结果就会很严重的,可能几天的功夫都白费了!
    我提一个关于倒平板的小细节吧:怎样倒平板才能尽量少的产生冷凝水?
    1.要等熔化的固体培养基温度大概被手背温度高一点(即不烫手背)的时候才开始倒。2.倒好的培养皿最好一个叠着一个,这样就让培养皿盖子的温度和培养基的温度不会相差太远,冷凝水就容易产生。
  • "怎样倒平板才能尽量少的产生冷凝水?"
    1、如果是有抗性的平板可以,开开盖子,用洁净风在超净台里吹20min
    2、正常的不烫手的温度倒平板大约40-50度之间即可
    3、放在37度检菌1天的过程,也会使冷凝水蒸发,所以 呵呵 一举两得
  • 微生物实验室可能大部分把用过的培养基(含菌的)直接作丢弃处理,没有经过彻底的灭菌,这样不仅污染了实验室本身人员的安全,还造成了极大的环境污染,危害是很大的,就SARS病毒研究过程中就出现过实验室由于不小心造成试验研究人员感染,这是十分危险且得不偿失的。
    据我们老板讲(香港大学博士),在香港大学的研究室内,有专门的实验室垃圾处理人员,每天两次回收实验室产生的垃圾,经过彻底的高温高压灭菌之后才能做丢弃处理,这是对自己对大家的负责的做法,连装垃圾的带子都是统一订制的。我觉得这是很值得提倡的一项做法。
    其实实验室条件如果达不到这种实力(可能大部分都很难达到),自己准备一个高压锅或者最简单的电炉子,长过菌的就拿去狠狠的煮煮,特别是芽孢杆菌之类难以消灭的,是对大家都有好处的。
  • 菌株活化的时候,要先接到平板上,再挑取菌落摇菌,而不要贪图方便省了平板活化这一步。
  • 高压灭过的固体材料,一般都有较多的冷凝水,问题不大但要烘干,一般是70度,时间至少三小时以上,保证没有冷凝水,这样一周内使用不会引起染菌.微生物实验的无菌要求是严格的,染菌的话,实验往往失败.
  • 1 实验过程中要及时详细标清除产物和日期,实验做完以后要对以前的过度产品做个清理,以免东西积累过多,自己都搞不清楚是什么东西。
    2 实验后的DNA和RNA要及时放回冰箱,以免时间长降解,特别是用水溶解的时候。
    3 要及时甘油保存你鉴定出的细菌,每个细菌保存两份,存放在-80度冰箱里。
    4 实验用的酶类虽然在室温下放一段时间也没什么问题,但还是要及时放回冰箱,以免活性降低。
    5 要及时清理实验台面,该仍的东西及时扔掉,保持干净,整洁,有序。
    6 无菌操作台用后及时清理干净,操作真菌,细菌,酵母,昆虫细胞最好不要交叉使用。
    7 培养基使用的时候要注意无菌操作,移液器不要插入培养基中,之准许无菌枪头进入瓶子腔体,如培养基较少,可以倾斜瓶子,移液器取液体最好不要用到最大量程,以免吸液过猛导致与移液器接触。
    8 灭好的培养基标签一定要写好,包括名称,日期,是否加抗生素,是否加抗生素非常重要,特别是在共用培养基的实验室。
    9 实验用过的试剂盖子一定要盖好,以免挥发。特别是有毒的物品,如氯仿,苯酚等,用完后的瓶子及时拿出实验室。
    10 带手套接触有毒物品后,要及时处理掉手套。不管是否接触过有毒物品,,不要戴着手套乱接触其他东西,如开窗等。
    11 做实验过程中不要接电话,说话,考虑其他事情。特别是PCR和配溶液的时候。做PCR和配溶液的时候要把所用的试剂找全,一字排开,加完一种东西就把这种东西放到一边,可防止自己少加错东西。
    12 同时作几个实验的时候一定要有定时器,防止自己忘记,特别是在煮东西,加热溶化溶液等危险操作的时候,切忌。
    13 饭前,有活动前不要做实验,这时候匆匆忙忙非常容易出错,特别是作有危险的实验,更要注意。
    14 作好试验记录,不管有没有结果,一定要坚持。还有点用图片,测序结果等,如果不清楚记录东西多了,就乱了,混了。这个一定要认真做好。
    15 要随时写下自己的想法,因为有些想法稍纵即逝。
  • 挑选菌落时不应把接种针(环)在平板上看似空白的区域冷却,那样往往导致污染杂菌,因为好多匍匐生长的菌落肉眼根本不易发现
  • 不知道是不是常犯,反正昨天犯了以后撞墙的心都有啦
    晚上心急火燎的倒了两种平板,共约50块,因为时间紧,同时培养基又是一种白色一种黄色,就没有作标记就回去了
    结果今天来了一看,全变成黄不拉唧一个色了,白的也不白了黄的也没那么黄了
  • 酵母膏可以用硫酸纸称过之后直接放在溶液里 用玻璃棒搅拌溶解之后用镊子将硫酸纸取出
  • 超净台需要定期清洗,不只是台面哦.而且需要色深的布遮住光是最好的(防止光修复)
  • 微生物室比较常犯的错误如:
    1.标识不明或者根本就不标识
    2.不能有效地区分灭菌与非灭菌物品
    3.交叉污染:在超净台上工作时,不能相应地区分清洁区、工作区、污染区;在清洁实验室时也容易发生交叉污染。
    4.典型菌株在整个使用过程中不能有效防止泄漏。
  • 用过的长菌的平板和培养液,应该先在灭菌锅中高压灭菌后再扔掉,即便做的是对人畜无害的细菌,也要灭掉,据说会有噬菌体污染的情况出现。未被灭掉的细菌引来的噬菌体,造成整个实验室噬菌体污染,那样再做细菌培养就养不起来了~~~~而且没有办法除去噬菌体
    培养基如果有水可以放在50度干燥箱烘30分钟,不过拿出来以后要冷却一段时间再使用~~~
    听说过一个最笨的错误~~~一位猛人向超净台燃烧着酒精灯加酒精,结果自然是把超净台给烧了~~~而且这位猛人是研三的~~~~
  • 看到大家的发言,受益匪浅,微生物试验虽然简单,但是很容易出错,细节不注意就会导致实验的失败,“细节出真知”,同样也适用于微生物试验,以下是有关接种环使用中的注意事项,希望和大家共同探讨交流
    1、由被检验标本和培养物中取材观察细菌形态时,必须使用接种环。接种环或接种针每次使用前后,均须火焰灭菌。即在乙醇灯火焰上彻底烧灼1次,金属棒或玻璃棒部分亦须转动着通过火焰三次,用后灼烧时,先将近环处镍丝置于火焰中,使热导向接种环,如直接将环灼烧,则环上残余菌液可因突然受高热而爆裂四溅,有传染危险。待环上菌液蒸发干涸后,再将接种环以垂直方向于火焰中烧灼灭菌,最后再将金属棒或玻璃棒部分往复通过火焰。接种针用后灭菌时与接种环一样。
    2、接种环(针)经火焰后,需待冷却后再沾取标本或置于工作台上,以防烫死微生物或烧损桌面。
    3、由培养基或试管培养物中沾取标本时,培养瓶口、试管口在打开后及关闭前,应于火焰上通过1-2次,以杀死可能从空气中落入的杂菌和由培养物而来的致病菌。打开瓶塞或试管塞时,应将棉塞上端夹于手指间适当的位置,不得将棉塞任意放置别处。
    4、不染色标本和染色标本观察后,应立即投入消毒液内灭菌。
  • 从我的实验来看在配置培养基时,如果对pH要求很精确的话,那最好采用过滤灭菌。因为
    1)高温灭菌之后一般培养基的pH会降低
    2)pH过低的培养基,尤其是ph<4,高温灭菌之后,琼脂发生变化,可能是降解了,固体培养基不会凝固!!!!!
  • 微生物实验室最恐怖的就是污染问题了.要知道微生物是无处不在的.我觉得最常见,最头痛的就是菌种的污染了.
    微生物实验室的工作人员时刻要记得我做事之前我用的东西确信是无菌的吗?
    说说经常犯的一些错误吧.灭菌一定要记得标明时间.不然一多就忘了.
    灭菌前保证物品干燥,EP管,枪头等记得在盒子里面放灭菌指示条.
    无菌手套有时达不到效果,故用之前最好用75%酒精消消毒.
  • 我是初学者,刚进实验室不久,无菌观念不强,常犯一些低级错误。
    1.培养基灭菌一定要按照标准规定进行,有一次图省事,自己配完培养基后由于量比较少,所以就捎带着让别人给捎着灭了,结果没想到条件不一样,自己的培养基由于灭菌温度要求没人家高,结果分解了,导致配了半天白配。
    2.铺完平板后,冷却后放培养箱时一定要倒着放,有一次没注意,结果两天后做实验时培养基上全是水,既耽误时间有影响心情。
    我的经验就是做实验好习惯很重要,养成好习惯做起来就会很顺,否则就麻烦了。
  • 我进实验室后第一次用DNS法测酶活,因为中间有预热煮沸和冷却的等待时间,所以老师要求在空隙里穿插另外一个DNS酶活测试,第一次做的时候手忙脚乱,忙了这个忘那个。第二次做的时候我琢磨了一下,找了个小本,每做完一步就在本上记上,而且写明白这个步骤做完的时间和下个步骤开始的时间,两个实验各占纸的一面,这样哪步做了哪步没做就一目了然。呵呵,有点笨,但很管用。o(∩_∩)o...
  • 说几点吧:微生物实验操作难度不是很大,主要就是细节问题多要注意,看到大家上面说的都很好,楼主的主题也是很好的,学到许多。在制备培养基时,牛肉膏等黏性大的物质,称量时最好直接加入要灭菌的三角瓶中(做法:现将三角瓶放到天平上清零后再加。加时为避免加入过量,可将牛肉膏一点点粘到瓶壁上,过了可以抿回,不要跟加入的其它药品混杂。)。进口蛋白胨等贵重物质最好准备一张专用秤量纸。为了避免交叉污染,药匙在秤量不同药品前一定要用卫生纸擦净。还有超净在紫外灭菌时要用黑布遮盖蔽光,防止菌的光复活。接种时接种环要沾酒精后在酒精灯上烧红,每次换皿前要用酒精灯烧红接种环,避免交叉污染。先想到这写,与大家共享。
  • 筛选新转化的菌落,一定要有耐心,一次图的大肠杆菌板子长了24小时才出现菌落,差点被我扔掉。
  • 使用接种环灭菌器时一定要注意。我做实验时经常用到,有时做多了就有点不耐烦。特别是灭菌粗接种环时,瞅着它老也烧不红就着急了,心想反正不用手扶也能放住,先做点别的,比如在试管上写上编号什么的,写完正好再次用到接种环,这时候再拿出来正好能用。一般都没事,但一组实验做到最后一个就容易出问题,因为这时不再用接种环了,往往等东西都清理完了才想起来,这时候再看接种环…………那叫一个惨不忍睹啊…………
    我已经烧坏两个接种环了,现在,就是急死我也不敢把接种环直接放在接种环灭菌器里了!!!!!!!
  • 细菌在冰箱4℃平板保藏时间不要过长,隔一两个月要转接一次,自己曾经保藏三个月的细菌在冰箱中早就变成冰碴喳了,悔啊~
  • 我也是刚刚接触这方面的工作,这几天做质粒鉴定的实验刚刚犯下的错误,对新手可能有所借鉴,各位高手见笑了
    1.在提质粒前,往往我们先对菌株进行保种,然后剩余的菌液用来提质粒。这个时候一定要做好标记,稍微一疏忽,就不知道那个质粒是对应那个菌株了,不然提出来质粒即使验证正确也不知道哪管是了。
    2.跑电泳的时候,忘了检查电极了,结果全都倒着跑了,幸亏发现及时,还没有跑出去。师兄说,还好没跑出去,反过来接着跑还能回来,结果倒是可以。不过这种错误还是不要犯的好。
    3.做实验的时候仔细点,刚刚开始做微生物及分子的实验,最好集中精力,一不留神就可能犯错误甚至很低级的错误,比如那天提质粒说着话一不小心把漂洗液pw当成平衡液BL用来平衡柱子了,哎,浪费了几个柱子都没敢吱声。
    4.刚开始用移液器手发抖,特别是上样时,多练习练习,时间长了就好了,不要怀疑自己的选择,一个朋友说并非所有的外科医生都是天生拿手术刀的,我觉得有道理,时间长了就可以做好了。
  • 1.定期对菌株进行复壮
    2.冰箱中保存的菌株进行转接,以防over.
    3.灭菌锅要定期清洗,虽然用的是蒸馏水但也要经常清洗灭菌锅.特别是手提式灭菌锅,否则很容易将培养基污染(指带颜色的液体进入培养基)
    3.刷培养皿时要小心,玻璃易碎!
    4.使用pH计调节酸碱度时要注意电极,玻璃的易碎哦!
    5工作台内尽量少的放东西,特别是有些东西长时间紫外照射容易分解掉。
  • 再说说接种环灭菌器。直接把接种环放进去有烧坏的风险,但是说“绝对不可以直接放”也不对,毕竟可以省一点时间。那么万一(请注意,是“万一”)接种环被烧坏了该怎么处理呢?
    如果你发现接种环塑胶棒与金属棒相接的地方有些膨胀,或者塑胶棒轻微向下弯折,那么不要着急,它还有救。关掉灭菌器电源,一只手拿一个镊子,分别夹住接种环的金属棒和塑胶棒,小心从灭菌器中取出,平放在实验台上(不要接触纸或者纱布,会着火的。如果实验台不耐热,则需要垫上金属盘子),使塑胶棒和金属棒处在一条直线上,耐心等它冷却后,就可以再用了,只是膨胀的地方不会缩回去了,给你留个“纪念”。
    如果你发现接种环已经被烧成“拔丝铁棒”,或者塑胶棒已经被烧成了“糖稀”,那你就要动作快点了,要不然“黑色糖稀”会粘得到处都是。这时候要关掉灭菌器电源,拿个废液缸盛大半缸水,用两个镊子分别夹着塑胶棒完整的部分和金属棒(不要夹“糖稀”或“拔丝”部分,夹不起来,并且会粘住镊子的),小心取出,放进水中使之冷却,把还可以再用的金属丝卸下来,然后再扔掉。如果废液缸是塑料的,注意不要使金属棒接触废液缸,否则他们“亲密接触”后就不好分开了。如果靠近水池,也可以用自来水冲淋冷却。千万不要把接种环直接仍在台面上,那样熔化的胶会粘在台面上,你就慢慢刮吧。
    两种情况下都不可以用手直接去拿金属棒或者塑胶棒,除非你下定了决心,一定要给自己手上留点“记号”才能让自己心里长点“记性” 。
    不要把接种环留在灭菌器内让它自己冷却,因为灭菌器关掉后仍有余热,把接种环留在里面只会使事情变得更糟糕。
  • 无菌操作前进行紫外线灭菌并不是时间越长越好,一般20-30分钟就可以了,因为一般都习惯一关紫外灯就可开始操作,如果时间太长在紫外线照射下氧气会变成臭氧,在风机吹后会被实验操作人员吹入,对身体是有害的。时间长菌会被杀死,可是人也有可能被害哦,建议关闭紫外灯后,用风机吹1-2分钟后再开始操作。
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  • sharebio

    2012-08-31 11:24:56 sharebio 1楼

    看大家讨论这么热闹我也有感而发啦!是我在实验中的亲身体会!1、配液体培养基(是用大盐水瓶装的)一共配了五瓶,想着偷懒没有抽瓶里的空气或插一颗针头在塞子上面,直接放入高压锅进行高压,结果五瓶培养基有四瓶的瓶盖已经蹦开了,还有一瓶直接瓶底就已经破了。没办法又得重配!2、每次倒平板的时候最好是用紫外灯照射30分钟然后再倒平板,否则也容易长杂菌。曾经有一次晚上加班赶时间没照射直接在台面上倒平板,结果平板全部被污染。3、做PCR的时候曾经有一次配电泳液,没有三蒸水就用一般配培养基的纯水替代,结果跑了半个多小时也没见条带跑出来。没办法第二天又重配重跑!4、对现场采集的标本,接种平板以后,一般会有很多杂菌生长,对于目的菌的挑选和鉴定相对较困难,只有多麻烦一次,将可疑菌再次转种一次平板,这样对目的菌的检出率为大大提高。

  • sharebio

    2012-08-31 11:25:46 sharebio 2楼

    做微生物实验失败往往是由不注意细节导致的。上面的战友都说得很好,我再补充几点:
    1、大家在洗试管、摇瓶等玻璃仪器是往往是泡在水中,再往里面加入洗洁精进行清洗。洗洁精的主要成分是表面活性剂,很多酶对表面活性剂很敏感,容易被失活,所以用于测酶活的试管的清洗一定要注意清洗时把残留的洗洁精冲洗干净。一般情况下,能用清水洗干净的尽量不要用洗涤剂,即使要用到洗涤剂也应该把洗涤剂稀释好后用的时候再挤,减少残留的可能性。
    2、平板培养基培养微生物时,标记一定要标在培养皿底部,这样才不会混。这一点做微生物实验的人一般都知道,但工作后发现公司里的测定洁净室沉降菌的人他们不知道,我见过之后给他们指出但后来发现他们还是写在盖子上,郁闷,后来才得知他们制定标准操作规程都是这样的。
    3、平板培养基培养微生物最好底朝上,即可减少染菌的可能性又可减少培养基水份的丢失。对于在温度较高的情况下平板培养基培养生长较慢的菌时,最好在培养箱里用个敞口瓶装点水放在那里,因为时间一长培养基里的水份丢失严重不利于微生物的生长,有时候培养基会干掉或裂开。

  • sharebio

    2012-08-31 11:26:32 sharebio 3楼

    我也来说几点,入门不久,不知道有没用。
    1.一个实验室接连着用水浴箱,如果是从从高温到低温,可以用一个塑料袋装些冰块放在水浴箱里,温度降到比较快而且又好控制,到了指定温度时再把塑料袋拿出。
    2.平板标记时,除了标记在培养皿底部,如果字多,可以绕着边写一圈,不要写到中间去,我有一次就直着往中间写(transformation的时候),后来属菌落数目的时候就有点小麻烦。
    3.DNA 提取时,尤其是样本量多时,每次加过一样试剂就把tube移一个格子,这样万一中间有什么absent-minded,看看tube的位置,还可以有补救的机会。

  • sharebio

    2012-08-31 11:38:01 sharebio 4楼

    像沙门志贺类的细菌必须要血清学鉴定作为最终的鉴定结果,在做血清凝集的时候,接种环蘸取试剂盒的血清涂在玻片上以后,如果觉得一环不够要重新挑取的话,一定要烧环,一旦污染就是一整瓶全部废掉,那才叫损失惨重啊

  • sharebio

    2012-08-31 11:38:20 sharebio 5楼

    从大二到研二了,做了四年多的实验,最经常用到的东西估计就是灭菌锅了,经常有人会觉得漏气,我觉得做到以下两点可以避免漏气第一,锅盖上的排气管一定要插到那孔里第二,锅盖盖好后拧螺丝时,记得对称旋,这样子能尽可能地避免漏气

  • sharebio

    2012-08-31 11:39:02 sharebio 6楼

    给菌种保藏的一个建议:我在实验室做菌种保藏已经很久了,因为我有很多真菌要保藏,正常情况我们用斜面保藏的话三个月就要活化一次,这是因为以前很多人都用棉塞,我都是用硅胶塞,这也是透气的,但是透气性没有棉塞那么好,棉塞就是因为太容易透气了,所以培养基很容易干掉,三个月就要活化一次,现在我建议大家用硅胶塞,可以一年活化一次而且对菌的活性影响不大。

  • sharebio

    2012-08-31 11:39:18 sharebio 7楼

    在做微生物实验前,要用消毒剂(如0.1%新洁而灭、75%酒精等)彻底清洁,且配置消毒水的水最好是纯化水或注射用水,且应每月轮换使用,防止菌体产生耐药性;清洁结束后将灭好菌的衣物传入房间内,再用紫外灯或臭氧消毒杀灭残余 细菌。好了,微生物实验就可以开始了。 实验结束后,如果操作了致病菌一定要将操作台面及所有设备用消毒剂擦拭,再开紫外灯照30分钟,最后将所有的需要拿出操作间的物品(包括废弃物)收集起来,可灭菌的放到灭菌器中 121摄氏度灭菌30分钟,不能灭菌的放入消毒剂中浸泡一夜再清洗 。

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