[技巧经验]转化的要点及疑难解析

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sharebio 2012-09-06 11:02:45

1、 存放:超级感受态细胞必须从干冰运送包装箱取出直接放入–80°C冰箱的底部。一定不要用液氮来存感受态细胞。

1) 存放条件:超级感受态细胞对微小的温度改变也极度敏感,因此必须存放在–80°C冰箱的底部。即使是将细胞从一个冰箱转移到另一个冰箱也会导致转化效率的损失。采用BD Falcon 的14ml聚丙烯圆底试管:在转化实验中使用圆底14-ml BD Falcon聚丙烯试管(货号 #352059)也是关键之一。一般的试管容易被b-巯基乙醇降解。而极为重要的热激步骤的操作也是根据这种型号的试管优化的。

2) 分装细胞:分装细胞时务必保持置于冰上。将聚丙烯管放置在冰上等待细胞融化,分装的细胞装入预冷的试管中。而且,每次转化都用100 ml细胞也很重要,减少细胞体积必定减少转化效率。

2、 使用b-巯基乙醇(b-ME): 已经证明b-ME可以帮助提高转化效率。Stratagene提供的b-ME已经过稀释,可以直接使用。其它来源的b-ME使用时请参考相关文献。

3、 使用NZY+ 肉汤: Stratagene的超级、高级感受态细胞在热激处理后用NZY+ 培养基菌落生长最好。用其它培养基替代往往会造成效率降低。

4、 DNA的质量和用量:测定的最高转化效率的数值来自1 ml的0.01 ng/ml超螺旋pUC18 DNA转化100 ml 感受态细胞的实验结果。转化连接产物时,每100 ml细胞要求2 ml连接反应产物。通过使用50 ng DNA可以得到更多的克隆,但同时转化效率(cfu/mg) 有所降低。DNA溶液的体积可以增至总转化体系体积的10%,但是转化效率也相应降低。热激时间和温度: 最优的转化结果是采用42°C热激30秒。热激40秒均造成效率降低。温度不可超过42°C。

5、 蓝-白斑筛选: 特定重组质粒的蓝白斑筛选要求宿主菌含有F?附加体上的lacIqZ*M15 基因,而质粒提供a-互补(例如Stratagene的pBluescript? II系列载体等)。当IPTG诱导lacZ表达时,在含有发色底物X-gal的平板上,带有插入片段的重组质粒的克隆为白色,带有质粒却没有插入片段的克隆则为蓝色。做蓝白斑筛选时,将含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37°C下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4°C两小时,蓝色会加深。如果插入片段毒性较大,应采用没有X-gal and IPTG的培养平板。蓝白斑筛选虽然没办法做了,但是在没有IPTG时,毒蛋白或许有一定的表达。
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