ELISPOT标准操作程序
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第一天:ELISPOT包被程序,提供两种方案供选择(严格注意无菌操作)
 
方案A: 传统酒精预湿包被程序
该方案中,需经过:70%乙醇预湿PVDF膜、无菌去离子水洗涤去除乙醇、拍干,最后,加入已稀释好的包被抗体到各实验孔完成包被操作。
具体操作如下:
1.          实验卡片填写:设计好试验,把每个孔要加入的内容做成卡片,到时候就会从容很多。
2.          每孔加入15μL 70%的乙醇预湿。
注意:
²      未润湿PVDF膜是洁白、不透明的;经乙醇润湿后,颜色变暗,呈半透明状,很容易观察二者的区别。
²      加乙醇时,枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方,注意枪头不要刺到PVDF膜。
²      若加入的乙醇挂在孔壁上,盖上板盖,轻轻叩击,让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜,就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜,使得膜的颜色和透明度发生变化。
²      15μL是经过优化的体积,能保证刚好完全浸润整块膜,而不会有剩余。请勿随意加大用量!
²      膜在润湿后如果不做处理,大约10min后由于乙醇的挥发会重新变干。所以应该在膜变干之前加入去离子水,两步的时间间隔不要超过5min。否则,膜需要重新润湿。
3.          洗涤:100μL/孔加入去离子水,洗涤2次。
²    本次洗涤目的在于:除去预湿用的乙醇。因此应该尽量洗涤干净,减少残留。
4.          包被:按说明书操作。50μL/孔加入用1×PBS稀释好的包被抗体,4°C包被过夜。
5.          封闭:(次日)倾倒包被液,用无菌1×PBS洗涤3次。最后一次,在灭菌的吸水纸上扣干。200μL/孔加入稀释好的封闭液,37°C封闭1h。
6.          倾倒封闭液,无须洗涤,直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。
 
方案B: Magi™ Coating Buffer润湿包被程序
该方案中,用Magi™ Coating Buffer润湿PVDF孔后,直接加入用1×PBS稀释的包被抗体,即可完成抗体的包被。
1.          实验卡片填写:设计好试验,把每个孔要加入的内容做成卡片,到时候就会从容很多。
2.          每孔加入15μLMagi™ Coating Buffer预湿。
注意:
²      未润湿PVDF膜是洁白、不透明的,经Magi™ Coating Buffer润湿后,颜色变亮,呈半透明状,很容易观察二者的区别。
²      加Magi™ Coating Buffer时,枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方,注意枪头不要刺到PVDF膜。
²      若加入的Magi™ Coating Buffer挂在孔壁上,盖上板盖,轻轻叩击,让Magi™ Coating Buffer顺势滑落。Magi™ Coating Buffer一旦接触到PVDF膜,就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜,使得膜的颜色和透明度发生变化。
3.          包被:润湿之后,无须洗涤。每孔加入50μL PBS稀释好的包被抗体,4°C包被过夜。
4.          封闭:(次日)倾倒包被液,用PBS洗涤3次。最后一次,在灭菌的吸水纸上扣干。200μL/孔加入用1×PBS稀释好的封闭液,37°C封闭1h。
5.          倾倒封闭液,无须洗涤,直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。
第二天:接种细胞,加入刺激物,培养(严格注意无菌操作)
整个实验设置1组正对照(PHA刺激),每一个细胞样品(同一个捐献者或实验动物)要设1组负对照(不加刺激物),整块板还要加1组背景负对照(不含细胞,只加培养基和所有检测试剂)。
1.          填好实验卡片,用以指导实验安排及细胞和试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设复孔(建议2-4孔,客户可根据实验要求自行调整复孔数目)。
2.          取出封闭好的板,准备加入细胞。如果是以前做的封闭,先加入200μL的Lympho-Spot™无血清培养基室温静置10min,然后倾倒。
3.          细胞上板:按照实验卡片的安排,接种不同浓度的细胞,100μL/well,细胞在孔中的分布要尽量均匀(要诀是加入细胞之后,不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散,实际情况刚好相反)。
(1) 正对照:细胞浓度为1×10cells/well。
(2) 细胞样品:样品细胞浓度请实验者自行摸索调整,通常为1~5×105cells/well。
(3) 背景负对照:加入100μL的Lympho-Spot™无血清培养基,该孔即为背景负对照孔。
4.          刺激物:特异性刺激物和非特异性刺激物之分。
5.          正对照孔加入10μL PHA,终浓度1-4ug/mL,该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。
6.          加入实验者自己的刺激物(用Lympho-Spot™无血清培养基配制成10×终浓度,10μL/well)到实验孔。加完刺激物后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀。实际上,通过扩散,刺激物会很快混合均匀。拍击板子会让细胞聚集分布在孔的外周。
7.          加完所有的样品之后,盖上板盖,放入二氧化碳培养箱,37°C培养18-24h。
注意:
碰撞会引起细胞移位,造成斑点模糊、拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板,并尽量减少开关培养箱的次数。
               
第三天:培养后操作(不再需要无菌操作)
1.          裂解细胞:倾倒孔内的细胞及培养基,200μL/孔加入冰冷的去离子水,4°C冰浴10min(低渗法裂解细胞)。
2.          洗涤:每孔加入200μLPBST,浸泡3-5mins后扣出洗涤液,重复5次。最后一次,在吸水纸上扣干。
3.          加入检测抗体:每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体,37°C孵育1h。
4.          洗涤:每孔加入200μLPBST,浸泡3-5mins后扣出洗涤液,重复5次。最后一次,在吸水纸上扣干。
注意:
²        有实验者认为,洗涤检测抗体酶标亲和素时,膜的背面也需要清洗。经我们验证,不清洗膜的背面也完全可以得到满意的结果,但是如果清洗,背景会更干净一些。所以,清洗膜的背面为实验的优化步骤,是否略过,由实验者自行决定。
²        洗涤膜的背面,我们的方法是:在洗涤最后一次时,将去除塑料保护层的PVDF膜板底面浸入盛有干净PBST的浅托盘中,轻轻漂洗几次即可。
²        一定要将膜背面和塑料保护层上的液体甩干后,再合拢,盖上,不要划伤到膜。
5.          加入酶标亲和素:每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素,37°C 1小时。
6.          洗涤:每孔加入200μLPBST,浸泡3-5mins后扣出洗涤液,重复5次。最后一次,在吸水纸上扣干。
7.          显色:解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液,室温静置15-45min(在20 -25°C,显色25min较合适),注意避光。
8.          待斑点生长到适合的大小之后,以去离子水洗涤2遍,终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上,拍干细小的水珠,之后取下保护层,放在通风的地方,室温静置10-30min,让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内,防止膜发脆、破裂。
9.          将ELISPOT板置于Biosys Bioreader自动读板仪内,调节好合适的参数,斑点计数,并记录斑点的各种参数,做统计分析。

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