细胞中直接测量蛋白磷酸化方法
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此篇文章转自生物通的一篇新技术投递,供参考,有兴趣的可以网上搜索Cisbio Bioassays公司HTRF磷酸化蛋白测量试剂!

检测原理

实验可在细胞裂解液或者完整细胞中进行。当受体被刺激 后,引发了相关激酶的活化,导致下游蛋白被磷酸化。细胞膜裂解之后,磷酸化的蛋白释放出来,被HTRF试剂检测到。磷酸化蛋白的测量应用了双抗体夹心法, 两个抗体均为单克隆抗体。其中一个为抗磷酸化蛋白的抗体,标记Eu;另一个为抗蛋白其它位点的抗体,标记d2,见图1。这些抗体可以预先混合后,通过一次 加样来完成。所有的实验均可通过两步法或者一步法实现。

图1:HTRF磷酸化蛋白测量的实验过程

一步法:
细胞铺板,化合物刺激,细胞裂解和磷酸化蛋白检测均在同一个板孔中,不需要洗涤过程(图2a)。此方法更加适用于高通量筛选,并且在不影响HTRF优越性的前提下减少了试剂用量。

两步法:
细胞置于培养板中,化合物刺激后裂解细胞。将裂解液转移到检测板中,加入HTRF检测试剂检测磷酸化蛋白(图2b)。该方法可以观察细胞的存活和生长情况。


特点和优势

  • 应用HTRF技术,稳定、灵敏、可靠
  • 基于一抗的直接检测方法
  • 直接检测细胞裂解液,操作简单快速,可替代Western Blot和ELISA
  • 可用于细胞水平的高通量筛选,并且相比其它技术拥有更高的Z’值
  • 适用于多种类型的细胞,包括原代细胞
  • 适用于过表达和内源性受体

实验结果
磷酸化Akt (Ser473)检测
铺满的大鼠 Fao细胞去除血清3 小时之后,用不同浓度的胰岛素刺激10分钟。磷酸化的AKT(Ser 473)含量通过HTRF 磷酸化Akt试剂盒检测,结果见图3。

图2a:一步法操作步骤

图2b :两步法操作步骤

图3:胰岛素刺激Fao细胞后AKT(Ser 473)的磷酸化水平

磷酸化ERK1/2的检测
铺满的 CHO细胞用不同浓度的吗啡刺激10分钟,通过HTRF磷酸化ERK测量试剂盒检测磷酸化的ERK含量,结果见图4。

图4:吗啡刺激阿片受体3后ERK1/2的磷酸化水平

产品信息

目前已经上市的HTRF磷酸化蛋白检测试剂盒,列表如下:

Cellul’erk—胞外调节蛋白激酶磷酸化测量试剂盒
—直接测量细胞水平实验中磷酸化ERK1/2的含量

ERK1/2是许多信号传导通路的会聚点
1)GPCR通过G蛋白调节一系列细胞内功能,这些信号最后都可会聚到ERK1/2上(图1)。GPCR受到刺激后,可通过下列途径使ERK磷酸化:

通过激活效应分子,如腺苷酸环化酶和磷脂酶C来影响细胞内第二信使的浓度,如cAMP, 二酰甘油, 肌醇1,4,5-三磷酸和钙离子等,第二信使传递信号到细胞内,引起ERK磷酸化

介导Gαi/o, Gαs, Gαq/11和 Gα12/13 依赖的MAPK级联信号的活化,包括ERK级联信号的活化

G蛋白的α和βγ亚基可通过受体酪氨酸激酶的反式激活作用来刺激ERK

GPCR还可以G蛋白非依赖性途径来介导ERK1/2的活化,该途径是β–Arrestin依赖性的

图1:ERK磷酸化途径

2)通过受体酪氨酸激酶磷酸化ERK

以表面生长因子受体(EGFR)为例。EGF和EGFR结合后,激活 受体胞内的酪氨酸激酶活性,使EGFR被磷酸化。GRB2-SOS复合物与磷酸化的EGFR结合,SOS被活化。活化的SOS进一步活化小G蛋白Ras, 活化Ras-Raf-MAPK通路,ERK被磷酸化。

检测原理

受体受到刺激,ERK1/2被磷酸化。在细胞膜裂解之后,磷酸化的ERK1/2释放出来,通过基 于HTRF技术的双抗体夹心法被检测到。其中一个抗体是抗磷酸化ERK1/2的抗体,标记d2,另一个抗体是抗ERK1/2蛋白的抗体,标记Eu,如图2 所示。这些抗体可以预先混合后通过一次加样来完成。该方法直接检测细胞裂解液中的磷酸化ERK1/2的含量。

试剂盒应用HTRF技术,不需要洗涤,比Western Blot、 ELISA和其它基于微珠测试的方法更加简单快速。实验步骤可以是一步法或者两步法。

图2:磷酸化ERK1/2的检测原理

应用领域

Gi、Gs、Gq 蛋白偶联受体的活化
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的感应器
β–Arrestin 信号通路的研究
受体酪氨酸激酶(RTK)的活化

实验结果

Gαq/i偶联的受体活化
如图3所示,Rantes 和 MIP-Ib在室温条件下刺激CCR5受体(CHO,25,000细胞/孔),时间为10分钟,用HTRF Cellul’ERK试剂盒来测试磷酸化ERK1/2水平。EC50分别为2.8 nM和18.8 nM,与文献报道一致。

图3:CHO-CCR5中ERK1/2的磷酸化水平

筛选的稳定性

用Carbachol (卡巴胆碱)在室温刺激CHO-M1细胞,时间为10分钟(5,000细胞/孔,384浅孔板),结果如图4。

图4:用Cellul’erk进行筛选具有很好的稳定性

选择未刺激的细胞、1.3 μM Carbochol和4 μM Carbochol计算Z’值,分别对应实验的基础水平、EC80和EC100,每种条件50个重复,实验采用一步法。两个条件的Z’值均大于0.7,表明实验非常稳定,可用于高通量筛选。

MAPK信号通路的活化

用PMA刺激CHO-M1细胞(50,000细胞/孔),时间为10分钟,结果如图5。

图5:PMA刺激的CHO-M1细胞中ERK1/2的磷酸化水平

PMA是PKC的直接激活剂。该实验得到的EC50为9.6 nM,检测窗口为4.5。

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