酶切反应条件的优化

sharebio发表于 2012-09-27 11:13:04 432人阅读|0

当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中,加入适量的 DNA、内切酶和缓冲液,就可以获得最佳酶切效果。根据定义,在 50 μl 体系中,1 单位的限制性内切酶可以在 60 分钟内完全切割 1 μg 的底物 DNA。上述酶、DNA 与总反应体积的比值可以做为建立反应体系的参考数据。但是,目前大多数科研人员会遵循下表中所列的标准反应条件,使用 5-10 倍的过量酶切割DNA,这样有利于克服由于 DNA 来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败。NEB 整理了以下有关内切酶反应的经验和技巧,以助您达到最佳酶切效果。

“标准”反应体系

内切酶

• 从冰箱取出后请一直置于冰上。

• 酶最后加入到反应体系中。

• 加入酶之前将反应混合物混匀,可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁,然后在离心机中快速离心。切忌振荡混匀!

• 当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋 DNA 时,通常需要超过 1 unit/μg 的酶量以达到完全酶切。

DNA

• 避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。

• 甲基化的 DNA 会抑制某些酶的切割效率。

缓冲液

• 使用终浓度为 1X 的缓冲液。

• 根据实验需要加入终浓度为 100 μg/ml的 BSA(1: 100 稀释)。

• 在不需要 BSA 即可达到最佳活性的酶切反应中如果加入 BSA 也不会影响酶切效果。

反应总体积

• 建议在 50 μl 反应体系中消化 1 μg 底物 DNA。

• 为避免星号活性,甘油浓度应 < 5 %。

• 加入内切酶(贮存于 50% 甘油中)的量应不超过总体积的 10%。

• 使用以下技术,内切酶的反应条件可能未达到最佳反应条件:克隆、基因分型、突变检测、基因定位、探针制备、测序和甲基化检测等。

• 内切酶贮存液中的添加物(如:甘油和盐)和底物溶液中尚存的残余物(如:盐、EDTA 或乙醇)会导致小体积反应体系出现问题。NEB 提供了一系列高保真内切酶(方便建立反应体系。下述为小体积反应体系反应指南。

酶切反应体系的选择

反应时间

• 标准一小时。

• 可加入过量的酶以缩短反应时间,或者使用能够快速酶切的内切酶。

• 对于许多酶,都可以用更少单位的酶消化 16小时。

终止反应

若消化后的 DNA 不需要进行后续的实验操作:

• 用终止液终止反应【50% 甘油、50 mM EDTA(pH 8.0)和 0.05% 溴酚蓝(NEB #B7021)】。按每 50 μl 反应体系中加入 10 μl 的比例进行。若消化后的 DNA 需要进行后续的实验操作:

• 用热失活法。

• 利用商业化的离心柱或酚/氯仿抽提去除内切酶。

贮存

• 大多数内切酶建议保存在 -20℃。只有少数内切酶若贮存时间超过 30 天建议保存在-70℃。详细的贮存信息请参阅内切酶使用说明书或目录。

• 10X 反应缓冲液和 BSA 贮存液也应保存在 -20℃。

• 不要将 BSA 直接加入到 10X 反应缓冲液中再冻存,因为这样 BSA 会产生沉淀。

稳定性

• NEB 每 4 个月都会对所有的内切酶进行活性检测。最近一次的质检日期以及使用期限都标注在每管产品的标签上。

• 在任何情况下,都应尽可能的避免将酶置于高于 -20℃ 的温度下。

对照反应

如果在切割底物 DNA 时遇到了问题,建议加入以下对照实验:

• 没有加入内切酶的实验 DNA,以检测DNA 制备和反应缓冲液中是否存在污染。

• 加入了内切酶的对照 DNA(含有多个已知内切酶切割位点的 DNA,如 LambdaDNA 或腺病毒-2 DNA),以检测内切酶的活性。

• 如果对照 DNA 能够被切割而实验中的底物 DNA 不能,可以将这两种 DNA 混合在一起再进行酶切,以检测实验用的底物 DNA 中是否存在抑制反应的物质。如果确实存在某种抑制因子(通常为盐、EDTA 或酚),则混合之后对照 DNA 也不能被切割。

注意:由于某些酶与 DNA 结合的亲和性非常高,所以不能很好地与产物分离。这样在进行琼脂糖凝胶电泳时就会出现弥散现象。若出现这种情况,可以在反应结束后加入终浓度为 0.1-0.5% 的 SDS,带型会更加清晰。

为了选择合适的内切酶,请登录 NEB 网站 www.neb-china.com 及 www.neb.com 上的 Enzyme Finder 软件。输入您所要查找的内切酶名称、识别序列、产生的末端类型或者内切酶种类,就能找到最适用的酶。

本文找生物摘选自NEB公司网站技术资料部分,原文网址:http://www.neb-china.com/tshow.asp?id=34

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