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SPA预包被法CL-ELISA Kit研制方案

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一、实验目的:
1、根据目前市场对克伦特罗ELISA试剂盒的要求,研制符合市场需求的ELISA试剂盒产品;
2、结合目前实验室的现状和抗体水平,通过改变包被方法,优选出适合技术参数需要的产品,并稳定下来;
3、为以后试剂盒的开发奠定体系,并能从中吸取开发新试剂盒的经验和教训;
4、以此项目为契机,构建团队体系,打造团队协作的运作模式。
二、要求达到的技术指标:
1、灵敏度:0.1ppb;
2、回收率:70-110%;
3、精密度(变异系数):<15%;
4、稳定性:试剂盒能4℃保存12个月时间没有明显变化;
5、除洗涤液和PBS液外,其他试剂均需提供工作液;
6、猪尿液样本无需处理,可直接使用。
三、人员协作与分工:
1、项目组组长:
2、参与人员:
3、人员分工:
(1) ×××:负责克伦特罗单克隆抗体的制备与纯化,抗体效价、特异性、亲和力等方面的系统检测与评价;保障实验用材料的供给;对试剂盒进行复核和检测,并保留原始数据;参与研发的各阶段的讨论。
(2)×××:负责克伦特罗-HRP的标记、纯化,标记物酶活性的鉴定与检测、标记物半抗原特异性结合力的鉴定与检测;CL-OVA包被原的合成、鉴定与检测;参与研发的各阶段的讨论。
(3) ×××:负责包被液、包被浓度、封闭液、标准曲线等各种条件的筛选与优化,使用猪尿液样品对添加浓度进行实测,选择尿样不少于20份(不同的猪个体及场地),具体负责SPA预包被法和二抗预包被法的筛选和优化,所有原始数据必须保留和存档;参与研发的各阶段的讨论。
(4)×××: 负责抗体、HRP标记物、酶标板等的防腐稳定实验,研究最佳配方拟定,建立稳定系统;负责配制显色系统,研究水溶性的显色系统;负责整个实验进程的跟进, 人员的协调,数据的收集与整理、分析,组织小组或会议讨论,建立整个产品的研制和生产工艺流程,最后拟定《克伦特罗ELISA试剂盒SOP》。
四、实验要求:
1、所有数据的计算均使用本院的ELISA计算软件;
2、数据必须科学、系统和完整,均需具备纸质和电子版;
3、书写必须规范,如:pH、mL、μL、mmol/L、mol/L等,不得使用简称。
五、技术路线:
1、应用原理示意图:


实验<1>

原理:实验<1>是利用SPA 能天然地与人及某些哺乳动物的IgG分子上的Fc片段结合,一个分子的SPA可以同2个IgG分子以化学共价键结合,对大白鼠、绵羊的亲和力差;对马、犊 牛、山羊等无亲和力,而且SPA与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。 SPA的结合力强,相当于游离抗体与抗原的结合力,结合后对IgG的活性无影响。再者SPA的颗粒均匀,能吸附固定在固相载体上,这样为SPA预包被提供 了条件。利用这点将SPA预包被在固相载体上,通过洗板封闭后与目标IgG抗体反应结合,能让目标IgG抗体非常有序的排列在固相载体上,大大增加了抗体 对抗原的有效结合位点, 导致检测灵敏度大幅提高。

1、 技术路线:

图一 ELISA试剂盒批量生产研究技术路线

图二 试剂盒标准化技术路线图

图三 整体实验方案技术路线图

图四  生产流程图

六、使用材料及仪器设备:

1、关键性材料:CL-McAb、CL-HRP、高纯度SPA;

2、普通材料:96孔酶标板、8mL硼硅酸玻璃瓶(用于装抗体和HRP标记物)、8mL聚丙烯或聚碳酸酯朔料瓶(装底物)、5mL普通本色朔料瓶(用于装标准品)、50ml普通朔料瓶(用于装PBS或PBST浓缩液),超纯水

3、设 备:50-300μL 8或12道移液器、单道移液器20μL~200μL、100μL~1000μL,酶标仪、旋转蒸发仪或氮气吹干装置、可调恒温恒湿箱、紫外-可见分光光度 仪、微孔快速振荡器、包被机、96道洗板机、离心机、涡旋仪、洗耳球、容量瓶1L、加样槽、保鲜膜、电子分析天平0.001g、冰箱及冷柜(4℃展示 柜)4℃~-20℃、真空封口机、电子pH计、超纯水机、冷水机;

4、试剂的配制:

(1)    抗原包被液:0.05mol/L 碳酸盐缓冲液(CBS,pH9.6):Na2CO3 1.49g;NaHCO3 2.93g;用三蒸水定溶至1000mL,调pH为9.6;
(2)    抗体包被液:0.05mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH8.0):KH2PO4 1.35g;无水Na2HPO4 5.7g;NaCl 8.0g;KCl 0.2g;用三蒸水定溶至1000mL,调pH为8.0;用115℃高压(108KPa)灭菌20min;
(3)    0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4):KH2PO4 0.27g;无水Na2HPO4 1.14g;NaCl 8.0g;KCl 0.2g;用三蒸水定溶至1000mL,调pH为7.4;用115℃高压(108KPa)灭菌20min,加入Proclin300 0.3mL,4℃保存备用;
(4)    0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4):KH2PO4 0.54g;无水Na2HPO4 2.28g;NaCl 8.0g;KCl 0.2g、proclin300 0.3mL;用三蒸水定溶至1000mL,调pH为7.4;用115℃高压(108KPa)灭菌20min后,加入Proclin300 0.3mL,4℃保存备用;
(5)    洗涤液PBST:在pH7.4 PBS液的基础上加入Tween-20 0.05%,混匀,取少量PBS溶液溶解一定量的Tween-20后,用0.22μm的滤膜过滤除菌后,定溶到需要量;
(6)    封闭液:将明胶或小牛血清、胎牛血清或其他类惰性蛋白溶于pH7.4 PBST中,使用何种惰性蛋白需要根据实验结果确定,加酶标板保护剂;
(7)    柠檬酸缓冲液:无水Na2HPO4 15.22g;C6H8O7-H2O 9.75g;或Na2HPO4-12H2O36.8g和C6H8O7-H2O 10.2g,用三蒸水定溶为1000mL,pH为5.0~5.4;
(8)    底物A液配制:柠檬酸缓冲液中加入过氧化尿500μg、加入保护液,用柠檬酸缓冲液定溶为1000mL;
(9)    底物B液配制:TMB 700mg用40mL DMSO充分溶解,加入保护剂,定溶为1000mL;
(10)终止液(2mol/L H2SO4溶液):18mol/L浓硫酸100mL,缓慢滴加到三蒸水至900mL;
(11)酶结合物稀释液:pH7.4 PBST溶液,加入保护剂和防腐剂,用0.22μm的滤膜过滤除菌;
(12)抗体稀释液:pH7.4 PBST溶液,加入保护剂和防腐剂,用0.22μm的滤膜过滤除菌;
(13)样品提取液和标准品稀释液:pH7.4 PBS溶液90mL,加入10mL甲醇。
注:以上试剂中所有的用水必须讲究,均使用超纯水或三蒸水,对抗体和酶结合物等稀释液、包被液及底物系统用水需要达到色谱纯水。

七、实验方案设计:
1、
实验<1>SPA预包被后包被CL-McAb法:
(1)    技术要点:
1)SPA需要具有较高的纯度,能有效而牢固的结合到固相载体上。据有关文献记载,SPA可能会和一些质量一般的聚苯乙烯板结合不牢固,会在洗板过程中被洗脱,而影响检测灵敏度;
2)包被之前要对聚苯乙烯板经紫外线照射或甲醇活化后使用;据了解市场上有氨基化的酶标板,这样可能更有利于SPA的包被;
3)在做该项实验时需要筛选酶标板、SPA与酶标板结合牢固度,通过洗板次数来加以验证,可以使用酶标的兔二抗,通过包被好SPA后,用标记的兔二抗结合后,通过洗板次数后的OD值变化来加以验证SPA与固相载体、SPA与抗体的结合情况;
4)SPA包被浓度和抗体浓度的关系等数据要经方阵筛选。
(2)    步骤:
1)      SPA的选择,CL-McAb的纯化、效价检测、亲和力检测;CL-HRP的合成与鉴定;
2)      包被:
①    选 择纯度较高的SPA,将1mg的SPA用缓冲液(0.02mol/L pH7.4 PBS溶液+30%甘油)定溶为10mL为100μg/mL,4℃保存;取300μL用0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液2.7mL稀释,采用倍比稀释法稀释为5、2.5、1.25、0.625μg等4个浓度,每浓度包被24个孔(纵向8×3条),将 CL-McAb用0.02mol/L pH7.4 PBS溶液稀释为如方阵图中的8个浓度,在SPA包被的基础上,每个浓度包被12个孔(横向12×1条)。
②    通过方阵法确定SPA与单抗的最佳浓度;
③    方阵图:

单抗稀释倍数 SPA浓度(μg/mL)
5 2.5 1.25 0.625
1:1000
1:2000
1:3000
1:4000
1:5000
1:6000
1:7000
1:8000

④    包被方法及浓度的确定:

a、使用0.05mol/L pH9.6 CBS缓冲液作为包被液(经验确定法),按照方阵图中SPA的浓度包被酶标板,100μL/孔包被,倍比稀释,每个浓度包被24个孔(纵向8×3条),37℃温育2h后4℃过夜;b、使用PBST洗板3次,用筛选出的最佳封闭液200μL/孔封闭,37℃温育60min,弃去残液,PBST 250μL/孔洗板3次;c、用0.02mol/L pH7.4 PBS缓冲液+保护剂,按照方阵图单抗浓度稀释CL-McAb,100μL/孔在包被二抗的基础上包被单抗,每个浓度12孔(12×1条),37℃温育60min,弃去残液,PBST 250μL/孔洗板3次拍干。
⑤   操作步骤:a、在上述包被好的酶标板相同包被浓度的3个孔中分别加入用0.01mol/L pH7.4 PBS缓冲液(阴性猪尿?)稀释的CL标准品0、0.5、1ppb等三个浓度各50μL,再加入50μL CL-HRP的酶结合物稀释液,温育30min;b、甩掉酶标板孔中的残液,用PBST 250μL/孔洗板3次,拍干;c、加入100μL/孔的AB显色液,于室温下避光反应15min,待显色充分后,加入50μL/孔的终止液;d、用酶标仪读取450nm处的吸光值。选择0孔吸光值约为2.5为最佳配比浓度,另外计算添加回收率。1)      最 佳CL-HRP浓度的确定:采用最佳SPA与单抗包被浓度包被24个孔(三条),用CL-HRP以1μg/mL按倍比稀释出6各浓度,每个浓度4个孔(2 个0孔,2个1ppb),50μL/孔CL-HRP溶液,50μL/孔0.01mol/L pH7.4 PBS缓冲液,选择0孔OD值约为2.5的为最佳浓度。6各浓度梯度为:

CL-HRP稀释浓度(μg/mL) 1.00 0.50 0.25 0.125 0.06 0.03
OD450nm
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