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引物合成常见问题

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Q1.引物是如何合成的?

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

(1)    去保护:加入Deblocking脱去碱基上5′- OH的保护基团DMT,获得游离的5′- OH;

(2)    耦合:同时加入活化剂和新的碱基,新的碱基5′-OH仍然被DMT保护,3’端被活化与溶液中游离的5′-OH发生耦合反应;

(3)    封闭:耦合反应中极少数5′- OH没有参加反应,用封闭试剂终止其后继续发生反应;

(4)    氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

Q2.引物合成后如何处理?

切割与脱保护基:将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。

纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有:C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量:根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。

储存:分装抽干。

Q3.需要什么级别的引物?

根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用 引物长度要求 纯度级别要求
一般PCR扩增 < 60base HEPD
>60 base PAGE
诊断PCR扩增 < 40base HEPD, PAGE
DNA测序 20base左右 HEPD
亚克隆,点突变等 根据实验要求定 HEPD, PAGE,HPLC
基因构建(全基因合成) 根据实验要求定 HEPDPAGE
反义核酸 根据实验要求定 HEPDPAGE
修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC

 

Q4.引物的质量是不是跟序列有关?

四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者,国内公 司一般都做不了20个G以上的引物。实验证明,如果引物中有超过三个连续G的结构,传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和 PAGE方法都无效。

鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化障碍,对普通引物、高GC引物和无论长短的oligo d(G)都能得到同样的非常好的结果。

Q5.需要合成多少OD数?

根据实验目的确定。一般PCR扩增,2 OD引物,可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了。

Q6.如何计算引物的浓度?

引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下,我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul,称为保存浓度,而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积(微升)可直接参照合成报告单上推荐的体积,也可按下列方式计算:

V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量

引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意:1 OD260= 33 ug/ml。

Q7.如何计算引物的Tm值?

引物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。

长度为25base以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size*

*公式中,Size =引物长度。

Q8.引物(含修饰)的分子量是如何确定的?

非修饰的引物的分子量(MW)在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5,引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量,或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)+(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns-62.

NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混 合数,例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。

常规碱基分子量

Base Molecular Weight
A 313.21
C 289.18
G 329.21
T 304.19
I 314.2
U 290.17

常规修饰基团分子量

5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12

 

Q9.如何溶解引物?

干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好瞬时离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或 TE(pH8.0)缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低 (pH4-5),引物在这种条件下不稳定。

Q10.如何保存引物?

引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。

干  粉:运输时常温运输,-20℃可以保存一年。

储存液:配好后分装成几管,避免反复冻融,-20℃可以保存半年。

工作液:常规使用,4℃保存,也可-20℃保存,但应避免反复冻融。

修饰荧光引物:需要避光保存,尽快使用为宜。

Q11.最长可以合成多长的引物?

我们合成过100base的引物,但是产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80base。引物越长,出现问题的概率就越大,按照目前的引物合成效率,大于80base的粗产品,全长引物的百分比不高,后续处理还有丢失很多,最后的产量很低。

Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低,价格要高?

主要因为是修饰单体稳定性较差,偶连时间长,效率低,最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化,纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍,所以产品的价格也高。

Q13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。

Q14.为什么引物的OD260/OD280小于1.5?

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一 个20base同聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66

 

Q15.同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?

通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构 的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分 光光度计检测。

Q16.如何检测引物的纯度?

实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入 尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约 2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用银染方式染色。

Q17.已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反 复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特 别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

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