蛋白电泳中常犯的6条错误
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在大型凝胶的高分辨率双向电泳中,这也是蛋白质组学中最重要的分离方法之一,这些错误的后果会变得更为明显。来自GE Healthcare Life Sciences的Reiner Westermeier博士指出了电泳中常犯的几点错误。

1. 聚丙烯酰胺凝胶的交联系数的错误计算
聚丙烯酰胺凝胶的孔大小是由两种因素控制的:丙烯酰胺的总浓度T和交联度C:

其中a是丙烯酰胺的质量,以g为单位,b是亚甲基双丙烯酰胺的质量,以g为单位,V是体积,以mL为单位。

错误
有时候假设给定的丙烯酰胺总浓度T就是单位体积中丙烯酰胺的百分比,而交联系数C就是单位体积中亚甲基双丙烯酰胺的百分比。这导致凝胶中交联剂的含量过高,产生了不透明的凝胶,不但易碎,而且高度疏水。

正确的操作
根据上面的等式配置溶液,或者使用即用型的丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺储备液,它可从不同的来源购买到。

2. 聚丙烯酰胺凝胶的聚合温度和时间
丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的聚合通常在30分钟至一小时内发生。然而,在这段时间内,基质的形成并没有结束。所谓的沉默聚合仍在继续,直至完整的基质形成。这一部分的聚合过程需要数小时,并且只在室温(20-25°C)下才能高效开展。

错误
在有些实验室,聚丙烯酰胺凝胶在冰箱或冷库中聚合,或者在聚合开始后一个或几个小时就已经使用。这可能会造成分离的干扰,尤其是当蛋白必须在天然条件下分离时。并且,若下游必须开展质谱分析,那么未完全聚合的丙烯酰胺单体或寡聚物会在质谱图中产生高的背景噪音。

正确的操作
让凝胶聚合在室温下过夜进行。如果需要,凝胶可随后储存在冰箱或冷库中。

3. SDS样品中产生聚集物
单向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品通常须在1-2 % SDS和1 %(w/v)DTT(≈65 mM)或2 %(v/v)β-巯基乙醇(≈350 mM)存在时煮沸几分钟,以实现多肽链的彻底变性和解折叠。

错误
样品常常在冷却后直接上样到SDS凝胶中。通常还原剂被部分氧化,其中一部分半胱氨酸不受保护,导致重折叠和多肽间聚集物的形成。重折叠形成模糊的区带,有时是两条带。一些聚集物在高分子量区域形成了人为的区带;其他聚集物则过大,无法进入凝胶,在点样孔形成了沉淀聚集。还原剂的过量可能在整个凝胶上40-60 kDa的分子量范围内形成两条或三条水平线。

正确的操作
煮沸后让样品冷却至60°C左右,然后加入碘乙酰胺。通常我们在100 μl样品中加入10 μl 20%(w/v)的碘乙酰胺水溶液,并在室温下孵育30分钟。
通过这一步,我们可以获得更为锐利的条带,并排除了一些假象,如两条带、其他的高分子量条带、点样孔中的沉淀,以及凝胶上的线。

4. SDS电泳中运行缓冲液的滴定
到目前为止,大部分单向和双向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用是在基于Lämmli的不连续缓冲液系统中开展的[1]。其他基于磷酸盐、咪唑或其他缓冲液的均一系统表现出的分辨率和重复性不高。在不连续的“Lämmli”系统中,积层胶和分离胶缓冲液是由指定pH值的Tris和氯离子缓冲液组成的 – 其中含有或不含SDS,运行缓冲液中则包含SDS、Tris和甘氨酸。氯离子作为前导离子和甘氨酸作为尾随离子之间的不连续性控制蛋白缓慢进入聚丙烯酰胺凝胶,并实现积层效应,产生非常锐利和清晰可辨的区带。

错误
不幸的是,有一些操作步骤建议将Tris-甘氨酸缓冲液的pH调整至pH 8.3-8.4。这导致上层缓冲液槽中的氯离子载量过高,产生下列影响:分离将比预期时间要长得多,且一些区带不好分辨。因氯离子相对其他所有离子有着非常高的电泳迁移率,所以只有氯离子向阳极方向迁移,直到上层缓冲液槽中没有任何的氯离子剩余。到那时蛋白离子才会开始迁移。在大型的电泳槽中,这需要几个小时至过夜。此外,积层效果也不如理想的不连续缓冲液那样好。

正确的操作
只使用Tris碱、甘氨酸和SDS作为运行缓冲液。请勿滴定缓冲液,即使它的pH高于9。使用高质量的试剂。

参考文献
[1] Lämmli , U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680–685.

5. 细胞中PBS的不彻底去除
在裂解细胞,分离出蛋白进行高分辨率的双向电泳之前,必须用等渗溶液对细胞培养物中的细胞进行高效洗涤。通常使用PBS(磷酸盐缓冲液)。

错误
PBS溶液有时未能从细胞中彻底去除。这导致样品中的盐污染,致使双向电泳图中出现许多长的水平条纹。

正确的操作
最后一次洗涤后,必须用移液器彻底吸光细胞中的PBS溶液,一滴也不剩。如果这不太容易做到,我们建议增加一步至三步洗涤,使用250 mM蔗糖和10 mM Tris(pH 7.0)的溶液。

6. 双向电泳中IPG胶条的过度聚焦
到目前为止,高分辨率的双向电泳为复杂蛋白混合物的分离带来了最高的分辨率。因此,它是蛋白质组分析中十分常用的方法。理想情况下,生成的双向图显示了所有蛋白的清晰可辨圆点。不幸的是,实际情况却常常不是这样:有时圆点的某些区域模糊,有时形成了水平或垂直条纹,取代了圆点。这些干扰可能有很多原因,过度聚焦就是其中之一。

如今在第一向分离即等电聚焦中大多采用了聚丙烯酰胺胶条,它们包含了固定化的pH梯度。由于pH梯度是固定在聚丙烯酰胺基质中的,所以当长期暴露在电场中时它不能散开。然而,过度聚焦会导致双向图像的一些其他干扰,具体会在下文中描述。

碱性pH梯度下的蛋白降解
当一些蛋白必须在它们的等电点停留一会时,它们不太稳定。实践表明,一些碱性蛋白在它们等电点的pH下对水解特别敏感。这可能导致某些蛋白点延伸出水平条纹。因此碱性IPG胶条的聚焦时间应当限制在最少。

“硫脲效应”
根据Rabiloud[2],在提取蛋白和水化IPG胶条时,向尿素中添加硫脲可提高疏水蛋白的溶解度。与只用尿素相比,生成的双向图显示出明显更多的点。然而,在某些情况下,在pH 5.5区域会形成一条很强的垂直条纹,而此条纹酸性一侧的点会比凝胶其他部分的点更加模糊。这种现象可能会观察到,但也并非存在于所有批次的硫脲中。但是它也与应用在IPG胶条上的伏小时相关。如果观察到这种现象,建议降低应用在IPG胶条上的伏小时量。

 

 

 

 

 

 

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