细胞爬片的保存和抗原修复问题总结

sharebio发表于 2013-03-26 13:47:11 454人阅读|1

1.  细胞爬片可以用含叠氮钠PBS液保存,但不知道具体浓度,请告知。
答:加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04-0.08%。但是我建议对于细胞爬片,还是尽量快的进行处理,以防不必要的问题!
2.  我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定,PBS冲洗后直接就放在了-20度,还能用于免疫组化吗?!
答:应该没有问题,但是还是现作先染好些,以防抗原的丢失
3.  mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。-20度保存。
4.  如果是4%多聚甲醛固定,然后放在PBS中保存,在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。
5.  丙酮中固定5-10分钟,然后风干,放置4度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜,蛋白质固定过度,会影响抗原的暴露,影响免疫组化结果。如果是胞浆 或胞核抗原出现假阴性结果,可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟,渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理,不要用其他抗原修复的方法, 会造成掉片,我曾有过这方面的体会。
6.  丙酮固定后,PBS洗涤3次,即可保存至4度冰箱备用。
7. (1)细胞爬片先用TBS洗3次,每次5分钟
(2)4%多聚甲醛固定,室温,20分钟
(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水,通风橱内干燥,-80度保存。2周没有问题的,我保存过2个月都有信号,不过还是保存时间短一点的好。
8.  我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好。
9.  细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定,用PBS冲洗后,晾干,放在-20度保存一个月没有问题的。
10.  细胞爬片,有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后,轻轻摇动玻片或培养皿等,静置2 min左右,弃去固定液,不用PBS洗而是采用空气干燥,干燥后的标本可于-70℃长期保存。解冻时要小心抗原破坏,应先将标本转移于干冰预冷的固定液, 然后再将混合液转移至室温下,固定液到达室温时取出标本,再用PBS冲洗,在做以后的步骤。
11.  我也做过细胞爬片的组化染色,不过没有遇到类似的问题。细胞培养好后用PBS洗一遍,然后4%多聚甲醛4度固定15分钟,自然风干。室温保存几周内都可 以用的。我想这可能与抗原的类型有关,有的对氧化等损伤比较敏感,有的差一些。最好避光保存在4度,同时尽量隔绝空气。免疫荧光与普通DAB显色差别只再 二抗的标记,样品的保存应该是没有多大差别的。
12.  细胞爬片丙酮固定后-20度保存,现在要再做免疫荧光,将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了。
13.  爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜,细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题,原因可能是:1)试验步骤有误,建议重复并加阳性对照片。 2)加一抗前处理同石蜡切片,可进行抗原修复,如胰酶消化或热修复。3)因为抗原抗体反应在液相中进行,故对已极度干燥的爬片充分水化很重要。建议试验前 用PBS浸泡过夜。如不能解决你的问题请QQ联系:81825645。本人在湖南省肿瘤医院病理科(长沙市)做免疫组化。
14.  4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以,也有用无水酒精的,固定好后放-20度,2-3个月是没有问题的。
15. 对于一般的细胞免疫组化,我的做法是:细胞爬片用冰的纯丙酮固定20 min,再在通风柜将丙酮吹干,—-20度保存,用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖,穿透性很强,保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定 剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。
如:1.多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
2.乙醇。优点:穿透性强、抗原性保存较好。缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。
3.甲醛(福尔马林)应用最广 优点:形态结构保存好,且穿透性强, 缺点: 甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
16. 4度是不能保存这么长时间(1个月)的,如果抗原已被分解,再修复也没用!
17.  弃去固定液,不用PBS洗而是采用空气干燥,干燥后的标本可于-70℃长期保存。
18.  爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒钟,然后在4%多聚甲醛中固定15分钟,然后再用37度去离子水将甲醛冲干净,注意手法轻柔,要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干,然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验,要不然玻片会掉下来的,就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在-20保存备用,具体能保存多长时间不太清楚,当然尽量早用。
19.  固定后放点PBS,然后放在4度冰箱中保存,我最长保存两个月的,然后再做免疫组化,应该没有太大的问题的。
20.  固定后4度可以存放一周,-20度存放半年,我现在也要做这个,实验室老师教的。
21.  四度放1周应该没问题的,你最好放在-20度,我在-20度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多,不可能一次作完,一个月没问题。
22.  最佳的固定及保存方法:
(1)中性缓冲福尔马林(不必调pH):
福尔马林(40%甲醛,用时加入过量碱式MgCO3中和) 10.0 ml
Na2HPO4.12H2O 1.9653 g
NaH2PO4.2H2O 0.5460 g
加0.85 %NaCl溶液溶解,定容至100 ml。
(2)细胞固定:待细胞接近长成单层时,用镊子取出盖玻片,迅速于37℃PBS中漂洗2次,每次3-5秒,以清除血清。
(3)将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30 min。
(4)用镊子取出盖玻片,PBS漂洗2次,每次3-5秒,晾干保存于-20℃备用。可长期保存,做实验时,取出片子,入PBS湿润后即可进行你的实验。
可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。
23.  细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱,1个月内可以用。
24.  过氧化氢处理这一步,用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢,然后室温下玻片放在其中浸泡10 min,是不是过氧化氢导致细胞严重脱片?
爬片应该用甲醇/双氧水,你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片。
25.  本人比较喜欢用4%得多聚甲醛,20分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干,不要挤压,防止粘片和碎裂。
26.  细胞爬片固定好以后,如果要保存,我们的做法是倒掉固定液,PBS漂洗后干片保存在4度,最长半年没问题。
27. (1)用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15 min,PBS (0.01 mol/l,pH7.4)洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了?
(2)爬片PBS (0.01 mol/l,pH7.4)洗涤3遍后是否能保存,怎样保存?
答:(1)洗过就可以做免疫组化了。
(2)固定过后自然干燥,不要洗,-20度保存。做之前再洗。
28.  细胞固定最好用丙酮或酒精,不要用4%多聚甲醛,以免抗原交联,这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可室温保存在丙酮中,不使之干燥。
29.  如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精。
30.  适当密度后取出固定(丙酮-20固定10~20 min),再进行免疫染色。
31.  一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上,冷丙酮固定15-20分钟,然后放-20度,没有问题。如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行,冷丙酮会腐蚀板子,最好4%多聚甲醛。
32.  细胞爬片用纯丙酮固定10分钟,取出干燥后用锡纸包裹,-70度保存。
33.  4%多聚甲醛固定后PBS水洗,自然干燥后用锡纸包裹,-20度冻存不超过1月。
34.  如果细胞贴壁困难,可将片子先用纯血清挂一层,凉干后再养细胞。
35.  可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片,商品名Thermanox Coverslips。高分子材料,耐高温灭菌,经过特殊表面处理,细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁剪,使用效果好。
上海生工有现货,不用国外定货。我使用后,觉得效果比玻璃盖玻片效果好很多。
36.  我们通常是把细胞玻片固定好后,用PBS冲洗干净,然后用酒精脱水(80%,90%,100%,100%酒精各一次,每次10分钟左右),然后放在烘箱里烘干,这是就相当于石蜡切片了,可以保存一定的时间。
这个方法我们试过的,保持一段时间后做,效果还是可以的。
本文转载自丁香园。






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