小技巧之琼脂糖凝胶电泳
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琼脂糖凝胶电泳对于现在的生物学操作就是小儿科,但是下面的一些小技巧您知道吗?
1 凝胶制作
1.1 给胶补点水:在日常的实验中一般都是一次多配点凝胶,下次融后直接使用。但有没有注意随着融化次数的增加,水分丢失也越多,凝胶浓度则会越来越高,导致实验结果不稳定。
补水办法:一是在容器上标记煮胶前的刻度,煮胶后补充相应的水分至原刻度;二是在煮胶前称重,煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(EB)可加在融化的琼脂糖中,终浓度为0.5 t*g/ml;也可在电泳结束后染色。
1.2 加速凝固:一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板,应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右。

2 点样
上样缓冲液中一般加了两种指示剂,溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂,DNA染色剂是溴化乙锭,而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6× (10×),使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直点样孔,用另一只手帮助固定移液器下端,移液器枪头(Tip)尖端进入点样孔即可将样品注入孔内,千万不可将Tip尖插至孔底。

3 电泳
电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同,电泳缓冲液刚好没过凝胶1 mm 为好,电泳缓冲液太多则电流加大,凝胶发热。电泳时凝胶上所加电压一般不超过5 v/cm(指的是正负电极之间的距离,而不是凝胶的长度),电泳时间一般为3O~60 min,根据实验需要也可作适当调整,电压增高,电泳时间缩短,核酸条带相对来说不够整齐,不够清晰;相反,电压降低,电泳时间较长,核酸条带整齐清晰。另外,如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动,请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。

4 结果分析
较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰,样品条带也整齐清晰,如果条带模糊暗淡,单从琼脂糖凝胶电泳角度来说,可能的原因:溴化乙锭的质和量怎样?溴化乙锭见光易分解,母液配制时间过长或保存不当(一般4℃ 避光保存一年内有效),或者终浓度没达到0.5 vg/ml;电泳槽中缓冲液使用次数过多,缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液,一般用2~3次就要更换,TBE缓冲液则可使用10次左右。
实际工作中经常发现DNA 分子量标准小片段模糊不清,那足因为琼脂糖凝胶浓度一般不会超过20% ,较小的核酸片段 在它的分辨范围之内,并且EB带正电荷,电泳时会向负傲移动,如果将凝胶置含EB的水溶液中30 min,较小的片段则可重新染色:另外,溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂,操作过程中要戴手套,并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存 。

找生物另附DNA电泳常见问题分析:

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