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小技巧之如何更准确的检测蛋白浓度
发表于54 天前 技巧 评论数 1 ⁄ 被围观 458+

 

Folin—酚试剂法(Lowry法)

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂配制较为困难,近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物)。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的含量成正比。

Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸钠(1%),硝酸钠(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。

进行测定时,加Folin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

紫外吸收法

由于蛋白质分子中,酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处,其吸光度与蛋白质含量成正比,可用作定量测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,低浓度的盐类不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,利用280nm进行紫外检测,来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。

此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

考马斯亮兰法(Bradford法)

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。

Bradford法的突出优点是:

(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是:

(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。

(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

BCA比色法

在碱性溶液中,蛋白质将Cu2+还愿为Cu+再与BCA试剂(4,4´-二羧酸-2,2´-二喹啉钠)生成紫色复合物,于562nm由最大吸收,其强度和蛋白质浓度成正比。此法的优点是单一试剂、终产物稳定,于lowry法相比几乎没有干扰物质的影响。尤其是在TritonX-100,SDS等表面活性剂中也可以测定。其灵敏度范围一般在10~1200 ug/ml。

常用蛋白质含量测定方法的比较

方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明
凯氏定氮法(Kjedahl法) 灵敏度低,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为 ±2% 费时8~10小时 将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定 非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离) 用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长
双缩脲法(Biuret法) 灵敏度低1~20mg 中速20~30分钟 多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物 硫酸铵;Tris缓冲液;

某些氨基酸

用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似
紫外吸收法 较为灵敏50~100mg 快速5~10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶;各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正
Folin-酚试剂法(Lowry法) 灵敏度高~5mg 慢速40~60

分钟

双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵;Tris缓冲液;

甘氨酸;

各种硫醇

耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1~5mg 快速5~15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液;TritonX-100;

SDS

最好的方法;干扰物质少;

颜色稳定;

颜色深浅随不同蛋白质变化

 

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