小技巧之Western Blot中如何消除内源的过氧化物酶
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找生物-分享有趣、实用的生物资源!本篇为转载,原作者为中国海洋大学的孙同学;转载链接为 <http://www.ebiotrade.com/newsf/2010-4/2010427165748399.htm>

Figure 1. Details of the steps involved in obtaining protein for western blot.

western blot sample preparation

 Figure 2. Figure detailing the steps in conducting a western blot.

western blot
项目:Western Blot中如何消除内源的过氧化物酶
背景:在Western Blot的显色中,常用的标记酶包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。其中HRP因特异性强、分子量小、稳定且作用底物范围广等优点而得到广泛使用。然而,某些细胞中存在大量线粒体,内源的过氧化物酶浓度自然比较高,它们可能会造成膜上出现一些“假的”条带。
方法改进:为了避免内源过氧化物酶对实验结果的影响,我们采用下列步骤来消除它。将制备好的胃壁细胞裂解液与上样缓冲液混合,上样到SDS-PAGE胶上。电泳之后,转膜。转膜之后,立即将膜放置在3% H2O2中,孵育15分钟。孵育之后,用TBS(25 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,pH 7.5)洗涤,之后用5%脱脂奶粉封闭。接着按照常规步骤进行下去。

结果:未用H2O2孵育之前,我们在膜上发现了一条约30 kDa的非特异条带。即使在不加一抗或二抗的情况下,依然在膜上显色,说明内源过氧化物酶存在。经过H2O2的孵育,这条带消失了。这种方法适用于线粒体较多的细胞(如肝细胞或中性粒细胞),能够让Western Blot的结果更加特异。

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