小技巧Western blot转印的优化
发表于213 天前 技巧 评论数 1 ⁄ 被围观 1,248+

找生物以前分享过一篇《WB过程中如何保证完美的蛋白转印》的文章,今天继续探讨WB转印过程中的优化小技巧!

从SDS凝胶中进行Western蛋白转印的优化需要对一系列参数进行考虑。目的是转印所有凝胶上的蛋白并将其定量地转移到转印膜上。进行高效转印需要一定程度的优化,尤其是对于大分子量和小分子量蛋白。

转印后,凝胶上应不残留或残留很少的蛋白。可以在转印后进行染色进行检测。转移出凝胶的蛋白应该仅在接触凝胶的膜的一面可见。如果有怀疑,在转印时 使用第二个”支持膜”,你可以在转膜后染色,以检查是否有穿膜的迹象。如果发现蛋白残留在凝胶上而且膜的结合性很差,可以考虑下列因素:

SDS vs 酒精

在多数转印实验步骤中都使用SDS和酒精。但两者对于成功的转印有相反的作用,需要根据欲转印蛋白的性质加以优化。

SDS对于蛋白的迁移是必要的,尤其有助于大分子量蛋白从凝胶上的转移。但由于膜结合需要疏水相互作用,SDS过多会抑制结合,尤其对于硝酸纤维素膜。 如果从蛋白上剥离太多SDS,将无法将蛋白转移出膜。作为一个一般性的规则,如果膜的结合力有效,但蛋白仍旧残留在凝胶上,在转印缓冲液中加入 0.01%会促进完全转印。建议的步骤在转印缓冲液中不含有SDS,但凝胶在电泳后不需要浸泡在转印缓冲液中;凝胶中残留的SDS对于有效的转印已经足 够。但另一方面,酒精通过在蛋白上剥离SDS促进蛋白和膜的疏水接合。一般在转印缓冲液中加入20%的甲醇会增加硝酸纤维素膜的接合能力。

凝胶浓度

丙烯酰胺浓度越低,蛋白越容易转移下来。选择可以分离蛋白的浓度最低的凝胶。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白,因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。

凝胶厚度

蛋白比较易于从薄胶上转移下来,所以上样体积允许,使用1.0mm厚的胶取代1.5mm的胶。

电场(电压×时间)

如果电压过低而且转印时间过短,部分蛋白会残留在凝胶上。如果电压过高,小蛋白会在结合到膜上前透膜而出。如果按建议的条件转印后有蛋白残留在胶 上,增加电压可能会有帮助,但不要超过5V。但注意,一旦SDS从蛋白剥离,增加转印时间或提高电压就无效果。一旦结合,即使延长转印时间,大部分蛋白也 会保持在膜上。

膜的类型

结合到硝酸纤维素膜上主要通过疏水键。硝酸纤维素膜对于常规使用非常好。对于小的多肽,建议使用小口径的膜。

PVDF比硝酸纤维素膜更疏水,在转印过程中结合蛋白更紧密,可以耐受更多的SDS。目前,PVDF一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件。其适用于蛋白测序。

尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合。其SDS耐受度甚至高于PVDF,但也需要更严谨的封闭条件。主要建议用于Northern和 Southern。

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