不使用kit:手工提取酵母DNA的方法

sharebio发表于 2012-08-30 15:13:01 429人阅读|0

原作者吐槽: 我刚刚来到一个新的研究所,欣喜的发现新实验室有很多不同类型的酵母DNA抽提试剂盒,我本人比较喜欢尝试使用新的kit和protocol,并且商家还总是声称自己的产品“方便、强大、高回收”等等,但是经历接下来的事后我对kit的使用就变得谨慎了!

在我打开一个kit的说明书时,看到上面赫然的写到“取细菌细胞……(take your bacterial cells)”,顿时错乱了,显然就是直接copy的抽提细菌DNA的说明书,懒得到家了。使用此kit结果也可想而知了,很难获得高质量的DNA,或者仅能获得低浓度的DNA样品。于是哥决定把它掷出窗外(那是不可能的),哥还是DIY一番吧!

备注:配图与本文无关!!

1) 使用YPD培养基10ml酵母菌30℃培养过夜;

2) 离心收集细胞,离心管放置冰上,轻轻倒出上清液,用0.5ml水重悬沉淀。转移细胞悬液至1.5ml罗盖管内,再次离心收集细胞沉淀;

3) 轻轻倒出上清液,在振荡器上剧烈震荡使残余的液体重悬细胞沉淀;

4)加入 0.3 ml Solution C: 2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1mM EDTA;

5) 加入 0.3 ml 酚:氯仿;

6) 加入酸化玻璃粉或锆珠,液体会高于玻璃粉2-3mm处,使用漩涡振荡器破碎细胞;

7) 加入0.2 ml TE (pH 8.0)溶液,震荡15秒,确保混合均匀;

8) 13,000 rpm 离心5分钟,转移上层液体至新离心管(原离心管应弃置于苯酚中);

9) 吸取水状层至新离心管,加入1ml 100%乙醇,反复颠倒混匀,于-20°C 放置30 分钟;

10) 13,000 rpm离心10 min, 弃去上清,用0.4ml TE重悬沉淀(此时含有大量的RNA,TE溶液中加入3µl 10mg/ml RNAse A溶液;

11) 于37°C孵育15分钟,加入10µl 3M 醋酸盐(pH 5.2),混合均匀,加入1ml100%乙醇,反复颠倒混匀

12) 13,000 rpm 离心10 min,弃上清,风干沉淀,用70%乙醇洗涤,再次离心去除乙醇,风干用 50 µl 水重悬。

至此结束,最终DNA浓度能达0.5 µg/µl。

作者后记:本秘籍迅速在本实验室以及其他酵母小组流传开来,从此江湖上又多了一个方便、强大、回收率高的DIY传说!

本文为找生物简单翻译的一篇文章,水平有限,难免会有错误,原文链接: http://bitesizebio.com/articles/look-ma-no-kit-a-diy-method-for-isolating-yeast-genomic-dna/






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