WB试验技术问题问答
发表于121 天前 技巧 评论数 5 ⁄ 被围观 1,186+

本文来自于GE公司的技术答疑集锦,针对于世界上第一个化学发光试剂ECL。

1,我的检测结果为什么无信号或者信号很弱?

1)可能原因:转移蛋白失败或者效率太低

重新检查印迹过程:使用染料对胶和膜染色来检测转移效果。或者使用预染的彩虹marker来帮助监控转印的过程。
优化胶体中的丙稀酰胺浓度,转移时间和电流等来提高转膜的效率。
确定印迹过程中胶体和膜正确接触,胶体和膜的朝向与电极连接正确。
确定在印迹过程中,是否冷凝效果不好导致高温产生了气泡或者胶/膜变性等情况从而影响了转印效率。

2)可能原因:检测系统

非常推荐使用斑点印迹系统检测抗原与一抗的结合效果,并筛选合适的浓度。对于一抗的优化,我们推荐起始浓度可以按照 1:100,1:500,1:1000,1:5000稀释,另外注意最优的一抗浓度需要根据所使用的抗体种属来源的不同而有所改变,除了抗体需要稀释优化 之外,经常值得改变一抗的种属来源,例如,对于化学发光检测(ECL, ECL Plus and ECL AdvanceTM),抗兔的一抗能产生较强的信号,但是对于ECL Plex,抗鼠的一抗能给予更强的信号,反之依然。对于ECL Plex CyDye™耦联的二抗我们推荐起始1:1250,1:1500,1:2500,1:3500和1:4000稀释。通常1:2500是ECL Plex二抗最理想的稀释。
确定检测试剂被正确保存并使用。确定检测试剂是否有效:在暗室内,预混合小计量的检测液1和检测液2(各0.5ml),并加入1μl的HRP标记的抗体,应可观察到蓝光。
低亲和力的一抗:使用无Tween的溶液。

3)可能原因:样品的上样量不够,信号过低

增加蛋白上样量,上样前浓缩样品。
使用灵敏度更高的检测体系。
延长曝光时间(1-2小时)。

4)可能原因:蛋白与膜结合较弱

转印缓冲液中的SDS(0.05%)可以提高转印效率,但是也会降低蛋白和膜的结合效率,可以降低SDS含量或者不使用SDS。
使用新换的膜以确定正确的水合作用。

2,我的Western Blot过程中背景总是很高,怎么回事?

1)可能原因:抗体浓度过高,信号太强,胶片超负荷

过高的一抗二抗都会带来高背景,增加抗体稀释倍数,采用斑点印迹技术筛选最合适的抗体浓度。

2)可能原因:封闭不充分

确定封闭液正确制备,并使用新配置的封闭液。
按需要提高封闭液的浓度(至少到10%)和封闭时间。
提高Tween浓度(提示:Tween可能降低抗体的结合力,特别对于低亲和力的一抗)。
延长孵育时间/或者封闭孵育的温度。
尝试替换封闭液:1-10%BSA TBS-T或者PBS-T(新配)。0.5-3% 明胶 TBS-T or PBS-T(新配),它们的孵育时间和温度将需要根据不同情况确定,从室温下1个小时到37℃或者50℃过夜均可。

3)可能原因:洗涤不充分

增加洗涤次数,时间和洗涤液的量。在清洗时加入少量的表面活性剂如SDS,比NP-40的去污力强,NP-40比Tween-20强。

4)可能原因:印迹器具,缓冲液被污染被污染

 清洗或替换所有设备,确定所有缓冲液都是新配和过滤过。

5)可能原因:膜的问题

确定膜被全部浸泡在液体中,特别是在洗涤步骤,膜充分水合。
使用新鲜的,高品质的膜:硝酸纤维素膜建议使用Hybond ECL。
膜的污染可能导致检测试剂的非特异性结合,使用手套和非锯齿型镊子对印迹进行小心操作。
洗涤步骤后要使用干净的镊子对印迹进行操作。

6)可能原因:曝光过度

尝试在在尽量短时间内曝光(至少15秒)。如果不宜再缩短曝光时间,可考虑降低抗体浓度。
再次曝光前,可将印迹放置盒中5-10分钟。
3,在使用新产品ECL Plex系统的时候需要注意些什么?

新推出的ECL Plex的主要优势是采用了两种荧光染料标记(Cy3,Cy5),从而在Western Blot实验中同时完成两种蛋白的分析,灵敏度更高,定量更精确。在使用ECL Plex检测系统中需要注意:
在进行多蛋白检测时,使用ECL Plex Cy5偶联的二抗来检测在你样品中非常低丰度的蛋白,因为ECL Plex Cy5偶联的二抗较ECL Plex Cy3灵敏一些。
在转膜前,凝胶前端的溴酚蓝应去除掉,因为在膜上的溴酚蓝也会给出荧光信号。
为了改善微弱信号的检测,跳过封闭,继而在转膜后直接干燥。室温下至少干燥两小时。也可以通过在操作中用PBS 0.1% TritonX-100代替PBS 0.1%Tween 20的方法来提高微弱信号的检测。
为了减少背景的干扰,使用的Hybond-ECL膜可以在扫描前干燥1小时(37℃到40℃)。但Hybond-ECL膜在干燥状态下很脆弱,我们并不推荐干燥。
如果你检测到了很多非特异性的蛋白条带,我们推荐你使用Hybond-LFP膜。使用2%ECL高级封闭试剂也给减少非特异性的结果。

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