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细胞培养在现在生物医学研究中得到了广泛的应用,从实验室的小规模细胞瓶培养到工业化的生物反应器培养。基础的科学研究到生物药品、疫苗的生产都离不开细胞培养。但细胞培养的历史您知道吗?找生物慢慢道来:

1856年,实现红豆杉细胞培养生产紫杉醇的突破。

1885年,Roux温生理盐水培育鸡胚组织(这可是完全的无血清培养基啊);

1887年,培养皿(英文:Petridish)由在德国生物学家罗伯特·科赫手下工作的细菌学家朱利斯·理查德·佩特里(Julius Richard Petri,1852-1921)于1887年设计,故也称为“佩特里皿”。是一种用于细胞培养的实验室器皿,由一个平面圆盘状的底和一个盖组成,一般用玻璃或塑料制成(这个是应用非常广泛的了,养细胞的不可能不知道培养皿的,但是我个人不知道还叫佩特里皿)。

1902年,植物细胞培养是在植物组织培养技术基础上发展起来的。 1902年Haberlandt确定了植物的单个细胞内存在其生命体的全部能力(全能性),使成为植物组织培养的开端。 其后,为了实现分裂组织的无限生长,对外植体的选择及培养基等方面进行了探索。

1906年,Beebe和Ewing用盖片悬滴培养法,以动物血清做培养基,培养狗淋巴细胞存活了72 小时。 现代细胞培养是从Harrison(1907)和Carrel(1912)两人开始的。 Harrison参考前人经验,创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法(具有里程碑的意义)。

1907年 ,哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基,培养蛙胚神经组织存活数周,并观察到神经细胞突起的生长过程,由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法,奠定了动物组织体外培养的基础。

1910-1912年,Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代,完善了悬滴培养法;

1912年, Haberlandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。 Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺,及添加各种氨基酸的培养基。

1915年,昆虫细胞培养的鼻祖是德国人forhardBendict(1878—1958),发表了有关昆虫细胞培养的第一篇文章。

1923年,Carral设计创立了卡氏瓶培养法,用此法可根据需要随时更换培养液,既有利于组织不断生长,又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞,极大地推动了当时组织培养研究。

在培养基方面,Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液,Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。

Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法,首建长期传代的L-细胞系;1948年Sanford创建单细胞分离培养法,获L-细胞纯系。

1948年, 体外细胞毒性试验细胞毒性实验它是利用体外细胞培养的方法,测定细胞溶解,抵制细胞生长的毒性作用来评价生物材料的潜在细胞毒性。

1948年,RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物,开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作。

1950年,Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告,开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。 作为大规模细胞培养,Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾细胞(BHK)的悬浮培养。

1951年,Dulbecco等采用胰蛋白酶消化组织培养法,获得了单层细胞培养,并开始应用人工合成培养液。  随着抗生素的普遍应用,体外培养细胞已经是分离、鉴定和大量培养病毒的简便而又十分有效的工具。

1951年,Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。

1952年,水痘—带状疱疹是由一种DNA病毒即水痘—带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV) 感染引起,该病毒1952年由Weller等首先通过细胞培养获得 (没有想到历史这么悠久啊,现在的水痘疫苗的基础啊)。

1954年,Peebles采自麻疹病人的材料进行人的肾脏细胞培养,从而成功地分离到病毒。 乙醚易使病毒钝化。 用人细胞、猴肾等作为第一代培养的细胞,再以FL.Hela细胞等的株细胞进一步增殖,并可在鸡胚的羊膜和绒毛尿囊膜上进行减毒增殖。

1955年,恩德斯(J.H.Enders)发表了用组织细胞培养分离麻疹病毒成功的报告。中国第一代医学病毒学家汤飞凡认为这是病毒方法学的一个突破,必须尽快掌握它。 1955年,他就领导闻仲权开始建立了人胚和猴肾细胞的组织培养。

1956年,支原体是一种能营独立生活的最小微生物,它没有坚韧的细胞壁,故其形态有较大的可塑性, 容易通过细菌滤器,是动物细胞系长期培养中常见的污染源。 1956年由Robison[‘〕首次从体外细胞培养物中分离出支原体。

1957年,各种培养瓶、培养基孕育而生。 1957年Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理,使成块的组织分散成单个细胞,进行悬液培养,从而开创了细胞培养技术。 用单层细胞培养法可以建立很多细胞系(cell line),通过单细胞分离培养法又可建立克隆细胞株(clone或cell strain)。(胰酶消化处理,也是细胞培养的常规技术了)

1958年,狂犬病毒适应于在细胞培养中增殖,随后利用该技术生产的细胞培养疫苗在安全性和效力上都日臻完善。

1958年,陈善明先生等老一辈科学家带领科研人员根据新疆地区的资源特点,首先开展了动物病毒学的研究,为新疆生物化学的研究开创了局。 利用兔肾、牛肾、羊肾和鸡脾等原代单层细胞,进行口蹄疫病毒的研究。 采用兔肾细胞培养出的A型III系口蹄疫苗,深受牧区广大牧民的欢迎。(中国的老科学家,让人敬佩啊)

1958年,日本科学家岗田用灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功。 后来科学家们又成功地诱导了不同种动物的体细胞融合,并且能将杂种细胞培养成活。 随着细胞融合技术的不断改进,现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学科的研究工作中。

1959年,美国M.Klein 等用牛肾细胞培养物最先分离到腺病毒(命名为“10”系腺病毒),其抗原结构类似于人腺病毒。1960年

1960年,人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。 正常情况下,人外周血小淋巴细胞都处在G1期(或G0期),但在体外给予一定的条件,进行培养,经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。 这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。

1961年,Hayflick首建人二倍体细胞系25种,开辟了应用新方向。

1962年,由Murashige和Skoog为烟草细胞培养设计的MS培养基,其特点是无机盐和离子浓度较高,是较稳定的离子平衡溶液,它的硝酸盐含量高,其养分的数量和比例合适,能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广,多数植物组织培养快速繁殖用。

1963年,进行了单细胞克隆。 原始的细胞株是成纤维细胞,贴壁依赖性。 但后来经无数次传代后细胞可悬浮生长,它广泛用于增殖各种病毒,生产兽用疫苗。

1964年,我国就开始进行人参细胞培养。

1965年,有学者在进行鱼类细胞培养时,首次发现鱼类细胞能够分泌类似哺乳类IFN的抗病毒活性物质,之后陆续发现多种鱼类机体和体外培养细胞均能诱生出IFN。

1966年,Steele和Breg成功的进行了羊水细胞培养及胎儿核型分析之后,使羊膜腔穿刺术广泛地应用于胎儿染色体疾病及先天性代谢病的产前… Cordocentesis),随后此方法开始广泛应用于胎儿疾病的产前诊断。

1967年,Mancini和Yates在鸡胚脑细胞培养中首次成功繁殖了AEV的VR株。 随后鸡胚成纤维细胞、肾细胞、神经胶质细胞和雏鸡胰细胞也被用于病毒适应株和野毒株的培养,病毒滴度,特别是自然毒株,一般较低,且未见细胞病变。

1967年, HyClone实验室创建于1967年,从为美国大学基础研究中的细胞培养开发高质量的胎牛血清做起,HyClone最先使用科学的收集方法和生产工艺生 产出了内毒素和血红蛋白含量极低的高品质血清。 第一个使用了高效过滤方法,大大的提高了FBS的质量和促生长特性。

1969年, 烟草的单个单倍体孢子培养成了完整的单倍体植株。

1970年,Melchers 在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。 1970年,PS Carlson 、H.Binding 和YM Heimer 等人分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。

1971年,地鼠肾细胞疫苗(PHKCV):原代地鼠肾细胞培养疫苗,加拿大、前苏联于1971年开始使用。

1972年,中空纤维细胞培养是由RA Knazek于1972年模拟体内微循环,设计了小型中空纤维细胞培养装置,中空纤维是用聚砜或丙烯的聚合物制成。 培养细胞在中空纤维上能不断从流动培养液获得营养物质,细胞代谢产物和分泌物又可随培养液的流动运走。

1973年,红豆杉细胞大量培养在我国也获得初步成功,从细胞培养物中得到了贵重的抗癌药物紫杉醇,但产率还有待提高。

1975年,角质形成细胞体外培养技术是在Rheinwald 和Green于1975 年创立的饲养层细胞培养方法的基础上逐渐发展起来的。

1975年,Sato成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株CH4,还有人用HamF12无血清细胞培养基成功地克隆了CHO细胞。

1976年,Van Wezel首次报道使用微载体培养动物细胞,创立了生物反应器微载体培养细胞工艺,使动物细胞培养进入高密度培养阶段。

1977年,Dexter创立了骨髓细胞长期培养,可支持粒系血细胞的分化和成熟。

1978年,植物细胞培养技术的应用范围得到了迅速发展, 利用体细胞无性系产生的大量变异,再结合人工诱变方法对植物组织或细胞进行突变体筛选,已经获得了许多抗病,抗虫,抗除草剂、矮秆、高蛋白等新品种。

1979年,Provost首次在体外培养成功后,HAV 可用多种原代及传代细胞株分离培养,如非洲绿猴肾细胞、人胚肾细胞、传代猴肾细胞(Vero、BSC- 1、FRhK-4)以及人2倍体肺细胞株(MRC5、KMB17)等。

1981年,Larkin等系统地论述了在植物体细胞培养再生植株的无性系变异以来,利用无性系进行突变体筛选来改良农作物品种。

1982年,Fridenshtein等发现并建立了以贴壁培养法为主要手段的分离扩增方法。

1983年,英国Wellcome公司就能够利用5000L的细胞罐进行大规模细胞培养生产口蹄疫疫苗;美国Genentech公司应用SV40为载体,将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达生产出乙型肝炎疫苗;

1987年,国外有人把培养的黑素细胞开始用于临床。 利用黑素细胞培养技术,可以把少量皮肤组织扩增培养出大量黑素细胞。 有人用来治疗白癜风等疾病,疗效满意,前景很好。 但是由于黑素细胞常用培养基中含佛波醇酯(TPA),存在致瘤危险,影响了这种方法在临床的应用。

1988年,Hofmann 等首次在培养基含胰酶的Vero 细胞上成功繁殖出PEDV,此后,该方法在PEDV 的分离、细胞培养和疫苗的研究中广泛应用。

1996年,Cha等发现在临床低传代分离株Toledo等病毒株中有一个包含19个开放阅读框(ORF, UL133~UL151)的区域,该区域是实验室株AD169所不具有的。

1997年, Laurain 等在1997年用野生型发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes A4菌株感染银杏合子胚诱导发根,建立了悬浮细胞培养系,同时用银杏胚囊(雌配子体)作外植体诱导,建立了悬浮培养系,用HPLC测定了GA、GB、 GC、GJ和BB的含量。

1999年,刘勇等成功地进行了胎儿椎间盘细胞的单层培养。 目前,国内外进行椎间盘细胞单层培养的实验研究较多,技术方法已经成熟。

在流加悬浮培养工艺方面,美国麻省理工Xie Liangzhi等人2000年报道在2L生物反应器中流加培养杂交瘤细胞,通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率,补充培养基包括营养成分、胎牛血清和痕量金属,最大活细胞密度达到1.7×107cells/mL。

2001年,美国Ohashi、Ryo等人报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。

2001年,瑞士Heine、 Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体。

2004年,德国Thomas等人在1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白,采取葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物,代谢转向TCA循环增加,活细胞密度保持在(1~2)×107cells/ml。

2005年,在新华奶牛场降生的被导入人乳铁蛋白基因的体细胞克隆牛耳朵成纤维细胞,经过细胞培养、克隆、胚胎培养和移植等技术实现的。 经相关技术鉴定,确系转基因体细胞克隆牛的再克隆体。 此次实验的妊娠率、出生率、存活率等均达到世界一流水平。

2007年,世界上第一个细胞培养生产的流感疫苗上市 ; 在2007年6月13日宣布,欧盟已经批准其流感疫苗Optaflu上市。

2007年11月,成功地用人类皮肤细胞培养出了诱导性多功能干细胞。 由于这项研究解决了胚胎干细胞研究所面临的伦理问题,因此将彻底改变干细胞研究的科学与政策,为生物医学研究开辟新的方向。

2008年9 月13日,日本京都大学日前宣布,该校教授山中伸弥开发的诱导多功能干细胞(iPS 细胞)培养方法已被日本特许厅(相当于专利局)授予专利,成为世界首个获得批准的iPS 细胞相关专利。

2009年10 月,TiGenix 收到欧洲委员会商业化ChondroCelect的批文,在冰岛、列支敦士登、挪威等27个国家作为先进治疗用医药产品(ATMPs)。 ChondroCelect是培养软骨细胞的细胞培养药物,用于提取自体健康软骨细胞培养放大后用于再移植手术治疗。

2010年,来自美国Wake Forest大学Baptist医学中心再生医学研究所的研究人员,利用人类肝细胞成功制造出像人类肝脏一样在实验室条件下功能齐全的微型肝脏。

随着生物技术的不断更新,细胞培养技术也日益完善,同时也出现了“克隆”的恐慌,但愿技术能够为人类造福,而不是带来毁灭!

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—— 找生物

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